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        二苯乙烯苷及其β-環(huán)糊精包合物在大鼠體內(nèi)藥代動力學研究*

        2011-07-14 01:56:52歐陽慧子任曉亮王貴芳戚愛棣
        天津中醫(yī)藥大學學報 2011年3期
        關(guān)鍵詞:包合物藥代苯乙烯

        歐陽慧子,任曉亮,王 強,王貴芳,趙 敏,戚愛棣

        中藥何首烏(Polygoni multiflori Radix)源于蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥塊莖,其特有指標性成分二苯乙烯苷(THSG),即2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(2,3,5,4-tetrahydroxyl-diphenylethylene-2-O-glu coside)(見圖1),具有抗肺腫瘤,抗動脈粥樣硬化,降低膽固醇和血脂,提高免疫力等多種藥理活性[1-4]。但由于THSG具有水溶液中穩(wěn)定性差、體內(nèi)生物利用度低的特點,在一定程度上限制了其臨床上的應用[5]。β-環(huán)糊精(β-CD)作為經(jīng)濟易得的藥用輔料,其安全性已被美國食品和藥物管理局(FDA)認證[6-7]。β-CD可以將藥物分子包入其空腔內(nèi),減小外部物理化學環(huán)境對其穩(wěn)定性的影響,繼而對藥物起到保護性作用[8-9]。筆者利用β-CD對THSG進行包合,發(fā)現(xiàn)β-CD改性后的THSG體外穩(wěn)定性有顯著提高,本研究對大鼠灌胃THSG及其β-CD包合物的藥代動力學行為進行研究,揭示β-CD包合作用對THSG體內(nèi)過程的影響,為THSG制劑開發(fā)以及臨床前應用奠定基礎。

        1 材料及方法

        1.1 儀器 Waters 600E高效液相色譜系統(tǒng)(美國Waters公司);AX205分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);N-EAVPTM111氮吹儀(美國Organomation公司);高速離心機(美國Tomos公司);超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

        1.2 藥品與試劑 THSG對照品(批號:110844-200606,中國藥品生物制品檢定所);黃芩苷對照品(批號:110715-200212,中國藥品生物制品檢定所);THSG提取物[自制,采用硅膠柱層析分離、重結(jié)晶純化制得,薄層色譜分析(TLC)顯示為單一斑點,二胺基聯(lián)苯胺(DAD)顯示為單一化合物峰,高效液相色譜(HPLC)法測定其純度≥96%];β-CD(孟州市華興生物化工有限責任公司);甲醇(色譜純,天津市康科德科技有限公司);乙腈(色譜純,天津市康科德科技有限公司);超純水(美國Millipore超純水制備系統(tǒng))。

        1.3 實驗動物 健康SD大鼠,級別SPF,雄性,體質(zhì)量200~220g,購自中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所,許可證號:SCXK(津)2005-000。

        1.4 包合物的制備 1g THSG提取物加入300 mL β-CD溶液(9 mol/L),10℃下避光攪拌6 h,4℃靜置過夜后減壓回收溶劑得包合物粉末,用少量乙醇洗滌后真空干燥,得到包合物粉末。經(jīng)熱重分析-差示量熱分析證實了THSG-β-CD包合物的形成,并用HPLC法測定該包合物中二苯乙烯苷含量為30.9%。

        1.5 血漿樣品預處理 取大鼠血漿250 μL,精密加入50μL甲醇,50μL內(nèi)標溶液(黃芩苷,1.4mg/L),渦旋10秒,加入0.2 mol/L的鹽酸溶液50 μL,渦旋1min,再加入甲醇750μL,渦旋3 min后14 000 r/min離心10 min。取上清液,氮氣吹干后,100 μL流動相復溶,14 000 r/min離心5 min,取上清液10 μL進樣分析。

        1.6 色譜條件 色譜柱:Warers SymmetryShieldTM RP-C18(150 mm×3.9 mm,5 μm);流動相:乙腈-水-磷酸[25∶75∶0.05;V∶V∶V];流速:1.0 mL/min;檢測波長:320 nm;柱溫:室溫。

        1.7 藥代動力學研究 20只大鼠隨機分成2組,每組10只,給藥前禁食12 h,自由攝水。按75 mg/kg(以THSG含量計算)的劑量,分別灌胃THSG-β-CD包合物溶液和THSG水溶液。其中每組5只均于給藥后 2、10、30、60、120、240 min,另 5 只于 5、20、40、90、180、360 min 從大鼠眼底靜脈叢取血,置肝素化試管中,離心(3 500 r/min)10 min,分離血漿,儲存于-20℃待測。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 特異性考察 分別取5只大鼠空白血漿各250 μL,除不加內(nèi)標溶液外,其余按“1.6”項下血漿樣品預處理操作和分析,得空白血漿色譜圖(見圖2A),將一定濃度待測物的對照品溶液和內(nèi)標溶液加入空白血漿中,依同法操作,獲得相應的色譜圖(見圖2B),THSG和內(nèi)標的保留時間分別為3.95 min和8.25 min,依同法獲得灌胃給予THSG后的血漿色譜圖(見圖2C)。結(jié)果表明,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾THSG和內(nèi)標的測定。

        2.2 標準曲線 取空白血漿各250 μL,加THSG對照品系列溶液50 μL,配制成相當于血漿濃度為0.025、0.050、0.10、0.20、0.80、1.60、3.20 mg/L 的 3 批血漿樣品,除不加50 μL甲醇外,按“1.5”項下樣品處理操作;以血漿中待測物濃度為橫坐標,待測物與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標,用加權(quán)最小二乘法進行回歸運算,求得直線回歸方程為Y=7.703 4X-0.161,r=0.998 7。根據(jù)標準曲線,THSG的線性范圍為0.025~3.20 mg/L,定量下限為0.025 mg/L。

        2.3 精密度與準確度 分別取大鼠空白血漿250 μL,按“2.2”項下方法配制成濃度為 0.05、0.20和0.80 mg/L的THSG低、中、高濃度質(zhì)量控制(QC)樣品各6份,與標準曲線同時測定,連續(xù)測定3 d,即每個濃度有18個樣品。根據(jù)當日的標準曲線,計算QC樣品的測得結(jié)果,進行方差分析,計算本法的準確度與精密度,結(jié)果見表1。

        表1 HPLC法測定大鼠血漿中THSG的精密度與準確度

        2.4 提取回收率 分別取濃度為0.05、0.20和0.80 mg/L的THSG低、中、高濃度血漿樣品各6份,按上述方法處理操作后進樣分析;同時以相應對照品溶液50 μL和內(nèi)標溶液50 μL加入處理過的大鼠空白血漿樣品渦流混合后進樣分析得峰面積,提取后的峰面積與之相比,比值計算提取回收率。大鼠血漿中3種濃度的THSG提取回收率分別為82.8%,83.5%和86.5%;內(nèi)標提取回收率為62.3%。

        2.5 穩(wěn)定性 取大鼠空白血漿250 μL,按“2.2”項下的方法配制成濃度為0.20 mg/L的血漿樣品,考察其在避光室溫放置4 h內(nèi)的穩(wěn)定性、血漿樣品1次和3次冷凍—解凍循環(huán)以及處理后樣品室溫放置24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明血漿樣品在不同條件下RSD均小于3.0%,表明大鼠血漿樣品在室溫避光,冷凍保存放置8 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.6 藥代動力學研究 SD大鼠灌胃THSG及包合物后,THSG的平均血藥濃度經(jīng)時曲線見圖3。血藥濃度數(shù)據(jù)用 DAS(Drug And Statistic 1.0)進行擬合,計算藥代動力學參數(shù),結(jié)果見表2。β-CD對THSG的改性作用對其藥代動力學過程有明顯的影響,主要表現(xiàn)為:1)達峰時間提前,THSG經(jīng)β-CD包合后在體內(nèi)吸收速度加快。2)達峰濃度增高,大鼠灌胃THSG后的Cmax為 0.24 mg/L;THSG-β-CD組的Cmax為 1.16 mg/L。3)THSG-β-CD 組的藥物在體內(nèi)停留趨勢比THSG組增加,MRT分別為89.01 min和72.76 min。4)β-CD包合物給藥后6 h THSG的AUC值是單獨給予THSG的近3倍,表明β-CD包合可顯著提高THSG口服生物利用度。

        3 討論

        THSG經(jīng)β-CD改性后口服生物利用度明顯提高,吸收半衰期變短,消除半衰期延長,藥物從體內(nèi)的表觀清除速率降低。推測可能由于THSG經(jīng)β-CD包合后其生物穩(wěn)定性增加,避免了藥物的分解和酶解。此外,β-CD可提高小腸細胞的膜通透性,增加藥物的吸收量,使藥物達峰時間提前且生物利用度提高。在胃腸環(huán)境中包合物與游離態(tài)THSG處于動態(tài)平衡狀態(tài),隨著游離THSG的吸收,包合物中的THSG不斷向環(huán)境中釋放,從而使得胃腸道環(huán)境中的THSG維持一個較高的濃度,增加了藥物在腸道中的吸收時間,提高了THSG的吸收效果。β-CD還可被結(jié)腸部位的腸道菌群所降解而釋放出藥物,使其攜帶藥物在到達結(jié)腸后才被釋放吸收,增加藥物的吸收部位。

        圖3 大鼠灌胃給予THSG和THSG-β-CD包合物血藥濃度-時間曲線

        表2 THSG及其β-CD包合物主要藥動學參數(shù)(±s,n=5)

        表2 THSG及其β-CD包合物主要藥動學參數(shù)(±s,n=5)

        注:與 THSG 比較,*P<0.05。

        藥代動力學參數(shù) THSG THSG-β-CD Tmax(min) 9.00± 2.24 5.00± 0.00 Cmax(mg/L) 0.24± 0.09 1.16± 0.80*AUC0-360min[mg/(L·min)]11.50±3.9732.24±7.77*MRT(min) 72.76± 7.99 89.01± 22.99 VRT(min) 2 963.10±241.84 8 698.29±2 454.49*

        THSG體內(nèi)降解產(chǎn)物分析:大鼠灌胃給予THSG后,血漿樣品的色譜圖中除THSG色譜峰外,還出現(xiàn)了2個新的色譜峰(tR分別為2.3 min和3.5 min,THSG為4.0 min)。此2個色譜峰的面積隨時間變化具有一定規(guī)律性,推測為THSG在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物色譜峰。其中tR=3.5 min的代謝物最為明顯,含量較高,推測是THSG在體內(nèi)最主要的代謝產(chǎn)物,通過后期膽汁排泄研究,證明其為THSG葡萄糖醛酸結(jié)合代謝產(chǎn)物。

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