劉雪平，胡 君

糖尿病足或肢端壞疽是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大頑癥，在中醫(yī)學(xué)屬“消渴”、“脫疽”范疇。千百年來，中醫(yī)治療糖尿病足大都采用中藥內(nèi)服、外洗等方法。藥物貼敷療法有著幾千年的歷史淵源，是源于“天然醫(yī)學(xué)”的中藥透皮吸收的綠色療法之一，具有適應(yīng)癥廣、操作簡便、療效明顯、經(jīng)濟(jì)安全的4大優(yōu)點(diǎn)。

外用丹黃消炎膏是本院外科在中醫(yī)整體辨證分型內(nèi)治的基礎(chǔ)上研制純中藥制劑，臨床外用于糖尿病足壞疽創(chuàng)面,療效較好，功能強(qiáng)調(diào)扶祛邪、祛腐生新，組方治則為扶正脫毒，活血解毒。臨床用于糖尿病足壞疽。其處方中含有金銀花、當(dāng)歸、黃柏等藥材，綠原酸是本品有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、解熱、升高白細(xì)胞、保肝利膽、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基等作用。

筆者借鑒傳統(tǒng)的水煎煮提取方式，取影響水煎煮提取的主要因素即煎煮次數(shù)、加水量、煎煮時間3個因素，各取3個水平進(jìn)行L9（34）正交實驗。以丹黃消炎膏提取干膏率及處方中的主要藥效物質(zhì)綠原酸含量為綜合評價指標(biāo)，篩選丹黃消炎膏的最佳提取工藝。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器 島津高效液相色譜儀LC—10ATVP（島津儀器（蘇州）有限公司N2000數(shù)據(jù)工作站），SPD—10A VP（浙江大學(xué)智能信息研究所）；色譜柱IrreguLar-H C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）；梅特勒—多利托電子天平AG—135（瑞士）（天津三維公司）。

1.2 藥品與試劑 綠原酸對照品：（中國藥品生物制品檢定所購置，批號：110753—200413）；藥材（天津飲片廠），乙腈（色譜純），磷酸（色譜純），純化水，其余試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 正交實驗設(shè)計 根據(jù)傳統(tǒng)提取方法以及藥材所含成分的理化性質(zhì)的需要，選定提取時間、加水量、提取次數(shù)作為考察因素,以樣品的干膏率及綠原酸含量綜合評分為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表設(shè)計進(jìn)行實驗方案，因素水平安排見表1。

表1 正交因素水平表

2.2 丹黃消炎膏提取液（簡稱提取液）的制備 稱取處方量的各藥材共9份，按L9（34）正交實驗表各列所示條件提取，濾過，合并濾液濃縮至100 mL，備用。

2.3 提取液干膏率測定方法 分別精密吸取提取液樣品各25 mL，置于恒質(zhì)量蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，移至干燥器內(nèi)冷卻30 min，精密稱定，依公式：

2.4 綠原酸的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱IrreguLar-H C18（250 mm×4.6 mm，10 μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸（12∶88）；流速：1 mL/min；檢測波長為327 nm；柱溫：室溫。理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于4 000。

2.4.2 對照品溶液的制備 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1mL含49.6μg的溶液，即得。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密稱取綠原酸對照品12.5 mg加甲醇使溶解并定容于25 mL容量瓶中，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液 1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL 分別置 25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得不同濃度的對照品溶液。吸取各濃度的溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積-濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=7.02×10-8X，r=0.999 8。

結(jié)果表明，綠原酸的進(jìn)樣量在0.2～2 μg之間與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.4.4 供試品溶液的制備及測定 取提取液1 mL置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，0.45 μm濾膜濾過，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定，即得。結(jié)果見表2。

表2 正交實驗方案及測定結(jié)果

2.4.5 加樣回收率實驗 采用加樣回收法，已知綠原酸濃度（2.97g/L）的提取液6份，分別置于50 mL容量瓶中，加入精密稱定的適量綠原酸對照品，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，濾過，測定，結(jié)果平均回收率為101.06%，RSD為1.846%。

2.4.6 重復(fù)性實驗 取同一供試品溶液，在2.4.1色譜條件下進(jìn)行測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.40%，表明本法重復(fù)性良好。

2.4.7 重現(xiàn)性實驗 取同一提取液6份，按2.4.4方法制得各供試品溶液，在2.4.1色譜條件下進(jìn)行測定，6份樣品含量的重現(xiàn)性良好，RSD為3.0%。

2.4.8 穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8、12、24 h 測定峰面積。結(jié)果 RSD 為1.93%,表明本溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性符合要求。

2.4.9 驗證實驗 根據(jù)篩選得到的最佳工藝提取3批樣品，測定綠原酸含量。

3 結(jié)果

3.1 正交實驗結(jié)果 對正交實驗結(jié)果作方差分析，所得方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析表

直觀分析結(jié)果表明，在所考察的影響因素中，重要性依次為A>B>C。A因素中A3>A2>A1；B因素中B3>B2>B1；C因素中C1>C3>C2。方差分析結(jié)果表明：A因素的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B 因素、C 因素的影響無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?？紤]生產(chǎn)成本因素，因此，確定最佳提取條件為A3B2C3，即加10倍量水，提取3次，每次2 h。

綜合評分=干膏率評分×0.4+綠原酸含量評分×0.6。

3.2 驗證實驗結(jié)果 根據(jù)篩選得到的最佳工藝A3B2C3提取3批樣品，測定干膏率和綠原酸含量，結(jié)果平均干膏率為38.783 3%，綠原酸平均含量為（3.877 7g/L），驗證實驗結(jié)果均高于正交實驗，說明所篩選的提取工藝條件穩(wěn)定可行。

4 討論

4.1 檢測波長的測定 取綠原酸對照品溶液在190～600 nm進(jìn)行光譜掃描，綠原酸在327 nm處有最大吸收峰，根據(jù)《中國藥典》[1]2005年版一部金銀花項下，最終確定327 nm為檢測波長。

4.2 流動相的選擇 作綠原酸測定時，最常用的是乙腈∶0.4%磷酸，通過試用不同比例的流動相測定，發(fā)現(xiàn)比例為乙腈—0.4%磷酸（12∶88）時可使色譜峰與相鄰峰達(dá)到基線分離，方法簡便，結(jié)果準(zhǔn)確。

4.3 綠原酸含量測定有干擾 本實驗在進(jìn)行綠原酸含量測定時候發(fā)現(xiàn)綠原酸有干擾，隨即提取了黃柏、金銀花雙陰性樣品及黃柏藥材樣品進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙陰性樣品亦略有干擾，經(jīng)查閱文獻(xiàn)得知可能是皂角刺造成，然后制備了金銀花、黃柏、皂角刺三陰性樣品及皂角刺藥材樣品，分別進(jìn)樣10 μL測定，結(jié)果三陰性樣品無干擾。見圖1-3。

有關(guān)皂角刺、關(guān)黃柏中綠原酸的含量測定有待進(jìn)一步實驗研究，本文不再贅述。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:152.