楊 虹，劉 虹，任曉亮，王 萌，朱曉月

劑學(xué)重點實驗室（劉 虹，任曉亮，王 萌，朱曉月）

香加皮（Cortex Periplocae）是蘿藦科植物杠柳（Periploca Sepium Bge.）的干燥根皮，因其含有強心苷成分，常用于治療急、慢性充血性心力衰竭。香加皮的臨床應(yīng)用通常以湯劑、藥材粉末或粗提物入藥，服用不便，患者順應(yīng)性較差；而且藥材中主要的強心苷成分杠柳毒苷的含量波動會造成制劑的質(zhì)量不穩(wěn)定，不利于臨床用藥的安全、有效。

中藥有效部位采用現(xiàn)代工藝有效去除雜質(zhì)、保留了有效成分，其有效成分含量達到50%以上，在保留原藥材功效的同時，實現(xiàn)了傳統(tǒng)中藥的精制。文獻中根據(jù)活性成分的不同性質(zhì)及在原料藥材中的不同含量采用的方法有：大孔樹脂法、分子蒸餾法、聚酰胺層析法、硅膠柱層析法、酸堿沉淀法等[1-2]。本研究在專利技術(shù)香加皮提取物[3]的基礎(chǔ)上，采用制備性快速柱結(jié)合精制柱進行香加皮抗心力衰竭有效部位的工藝研究。

1 儀器與試藥

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化廠），Waters 515高效液相色譜法（HPLC）。杠柳毒苷對照品（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%以上）；香加皮提取物（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院）；柱色譜硅膠（100～200目，青島海洋化工廠）；乙酸乙酯（分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；無水乙醇（分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司），超純水（美國Millipore超純水制備系統(tǒng)），甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

采用制備性快速柱結(jié)合精制柱分步富集的方法，逐級提高杠柳毒苷的含量，以達到制備工藝的穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟。以香加皮提取物（經(jīng)大孔樹脂處理，簡稱干膏1，杠柳毒苷含量2%～5%）為起點，通過制備性快速柱，采用低極性溶劑洗脫，使杠柳毒苷含量富集到20%～30%，得干膏2；再通過精制柱進行梯度洗脫，制得杠柳毒苷含量大于50%的有效部位。工藝路線見圖1。

圖1 香加皮抗心衰有效部位制備工藝路線圖

2.1 制備性快速柱工藝考察及驗證 杠柳毒苷的HPLC含量測定方法見參考文獻[4]。第1步富集所采用的制備性快速柱是利用低極性溶劑、短柱、超載實現(xiàn)杠柳毒苷含量的初步提高?？紤]到溶劑的低毒性，確定采用乙酸乙酯∶乙醇（25∶1）為洗脫溶劑，對干膏1與硅膠質(zhì)量比例進行了考察。

2.1.1 干膏1與硅膠質(zhì)量比例的考察 取5g干膏1，適量乙醇溶解，與10g硅膠混合制樣，分別另取10、20、40g硅膠干法裝柱（按干膏1與硅膠質(zhì)量比例分別稱為 1∶4 柱、1∶6 柱、1∶10 柱），上樣，以乙酸乙酯∶乙醇（25∶1）為洗脫溶劑，每 200 mL 為 1 份，用薄層色譜法（TLC）（展開劑為氯仿—甲醇—水65∶30∶10的下層，3，5-二硝基苯甲醛顯色）追蹤杠柳毒苷；減壓蒸干后用HPLC法測定各份固體中杠柳毒苷含量。HPLC測定結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出：隨著硅膠用量的增多，所得杠柳毒苷最高含量略有升高。選取TLC中有明顯強心苷斑點的洗脫部分，合并后減壓蒸干回收溶劑，得干膏2，測定其中杠柳毒苷含量，計算杠柳毒苷轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表1。

表1 不同比例干膏1與硅膠所制備的杠柳毒苷含量及轉(zhuǎn)移率

綜合考慮所得干膏2中杠柳毒苷含量、轉(zhuǎn)移率及節(jié)省硅膠降低成本的需要，確定采用1∶6柱，即干膏1與硅膠用量之比為1∶6進行第1步富集。

2.1.2 工藝驗證 對所確定的制備性快速柱工藝進行了多批次的驗證，結(jié)果見表2。所得干膏2杠柳毒苷平均含量為23.54%，杠柳毒苷轉(zhuǎn)移率平均為72.40%。

2.2 精制柱工藝考察及驗證 第2步富集采用硅膠長柱、梯度洗脫使杠柳毒苷含量達到50%以上。

2.2.1 對硅膠柱徑高比的考察 以干膏2為原料，1∶2硅膠比例制砂，濕法裝兩根硅膠柱，徑高比分別為 1∶9 和 1∶14，以乙酸乙酯∶乙醇梯度洗脫，薄層色譜法（TLC）追蹤杠柳毒苷，合并斑點顏色最深的2～3份，減壓蒸干回收溶劑，得干膏3，HPLC法測定其中杠柳毒苷含量，結(jié)果見表3。由表3可見，1∶14柱所得干膏3杠柳毒苷含量及收率均比1∶9柱高，因此確定采用1∶14柱，所得干膏3中杠柳毒苷含量達到50%以上，為香加皮抗心力衰竭有效部位。

表2 制備性快速柱驗證結(jié)果

表3 不同徑高比精制柱制備結(jié)果

2.2.2 工藝驗證 取5g干膏2按1∶2硅膠比例制砂，按照2.2.1確定的徑高比1∶14裝柱，以乙酸乙酯∶乙醇梯度洗脫，將TLC中強心苷顏色最深的2～3份合并，蒸干，HPLC法測定杠柳毒苷含量，計算杠柳毒苷轉(zhuǎn)移率。共重復(fù)10批，結(jié)果見表4。所得有效部位平均杠柳毒苷含量為58.23%，本步驟杠柳毒苷轉(zhuǎn)移率平均為60.12%。

表4 精制柱驗證結(jié)果

3 討論

中藥有效部位的研究是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的有力手段之一。本研究制得的香加皮抗心力衰竭有效部位中杠柳毒苷含量較高，達50%以上。相對于一般香加皮提取物而言，有效部位服用量小，便于制成注射劑、滴丸劑、緩控釋制劑等多種現(xiàn)代劑型，既能方便臨床應(yīng)用，又可提高患者順應(yīng)性；而且便于進行質(zhì)量控制。

曾以干膏1為原料，乙酸乙酯為溶劑，進行索氏提取，提取液蒸干后測定其中杠柳毒苷含量。結(jié)果表明，索氏提取前后杠柳毒苷含量沒有明顯提高。因此直接用制備性快速柱對杠柳毒苷進行富集。

在本研究中制備性快速柱參考了TLC法中杠柳毒苷的吸附行為。在TLC中，當(dāng)點樣量較小時，乙酸乙酯不能使強心苷類成分從硅膠上解吸附，所以展開后杠柳毒苷斑點基本保持在原點不動；而點樣量較大即發(fā)生樣品過載時，杠柳毒苷會從硅膠上解吸附，從而使強心苷斑點位置上移。這就預(yù)示著如果采用短柱、超載上樣、并選用低極性洗脫劑，可使杠柳毒苷從硅膠柱上洗脫下來，而大部分極性較大的雜質(zhì)仍被吸附在硅膠上，從而實現(xiàn)除雜、富集有效成分的目的。本實驗所選用的制備性快速柱，與普通的硅膠柱相比，上樣量大，生產(chǎn)周期縮短；低極性溶劑的使用，可造成極性較大的雜質(zhì)在硅膠上死吸附，除雜效果明顯，從而實現(xiàn)杠柳毒苷的快速富集。

本研究制備性快速柱和精制柱都選擇乙酸乙酯∶乙醇作為洗脫溶劑，所選用的溶劑安全低毒，適宜在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。本研究制定的工藝路線重復(fù)性較強，進行了多批次制備，即使原料含量有所波動，也可制備出有效部位，且收率基本穩(wěn)定，說明本實驗制定的香加皮抗心力衰竭有效部位的生產(chǎn)工藝安全、穩(wěn)定、重復(fù)性強。成本估算：計算使用的藥材、試劑、耗材、水電費，每毫克有效部位的成本不足1元，成本低廉，具有市場開發(fā)價值。

[1]高 英,李為民,倪 晨,等.分子蒸餾技術(shù)在分離蒼術(shù)油有效部位中的應(yīng)用[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2004，21（6）：476－478.

[2]佘白蓉，秦達念，佘運初.淫羊藿總黃酮精制方法的建立[J].中華實用中西醫(yī)雜志，2003，3（16）：1642－1643.

[3]劉 虹，孫 巍，王 萌，等.正交實驗優(yōu)化香加皮藥材的提取[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，25（1）：38-40.

[4]劉 虹，潘桂湘，高秀梅,等.HPLC法測定香加皮中杠柳毒苷的含量[J].中草藥，2004，35（5）：578，596.