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        穿龍薯蕷皂苷對障礙再生性貧血小鼠骨髓T細胞亞群的影響*

        2011-07-14 01:57:08張偉鋒劉寶山
        天津中醫(yī)藥大學學報 2011年3期
        關鍵詞:薯蕷雷公藤灌胃

        張偉鋒,劉寶山

        300193 天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院(劉寶山)

        再生障礙性貧血(簡稱再障)是造血系統(tǒng)的常見疾病,其發(fā)生的確切機制至今尚未完全闡明,目前多數(shù)學者認為再障的主要發(fā)病機制是免疫異常,而造血微環(huán)境與造血干/祖細胞量的改變是異常免疫損傷所致,其中T細胞亞群的異常在再障的發(fā)病過程中有著重要的作用[1]。

        穿山龍是薯蕷科薯菠屬植物穿龍薯蕷(Dioscorea napponica.Mak)的根莖,具有活血舒筋、祛痰截瘧、消食利水之效[2],穿龍薯蕷的主要化學成分為甾體皂苷類、是用于合成多種載體激素類藥物的重要原料之一,具有調節(jié)機體免疫的作用[3-5]。筆者應用穿龍薯蕷皂苷治療再生障礙性貧血小鼠,觀察其對骨髓T細胞亞群的表達的影響,報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物 近交系ICR小鼠,雌雄各半,6~8周齡,體質量(20±2)g(以上動物均購自中國醫(yī)學科學院放射研究所,經(jīng)檢疫合格,合格號(SCXK<京>2009-0004)。

        1.2 實驗用藥 薯蕷皂苷片(東盛科技股份有限公司西安制藥廠生產(chǎn),產(chǎn)品批號:200907035)。環(huán)孢素軟膠囊(華北制藥股份有限公司生產(chǎn),產(chǎn)品批號:100501),雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥有限公司,產(chǎn)品批號:1007119)。

        1.3 實驗試劑 環(huán)磷酰氨(CY),江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,10051421。氯霉素(CH),上海生工有限公司,CB0118-109。淋巴細胞分離液,中國醫(yī)學科學院血液學研究所無酚紅RPMI1640培養(yǎng)液,美國GBICO公司。優(yōu)質胎牛血清,德國BIOCHROM AG公司。PE/Cy5 anti-mouse CD4,美國BD公司。PE anti-mouse CD8a,美國BD公司。FITC anti-mouse CD3,美國BD公司。

        1.4 實驗儀器 超凈工作臺,蘇州凈化設備廠。恒溫CO2培養(yǎng)箱,美國Fisher公司。25 mL培養(yǎng)瓶,美國Corning公司。離心機,北京醫(yī)用離心機廠。倒置相差顯微鏡,日本Olnyrpus公司。流式細胞儀,美國Conlter制造廠。

        1.5 方法

        1.5.1 再障模型的建立 參照孫紀元等[1]報道方法,ICR 小鼠經(jīng) 60Coγ 射線(3Gy,劑量率 0.6,照射時間5min,距離4m)全身照射后,于第4、5、6天腹腔注射環(huán)磷酰氨(CY)50 mg/kg,氯霉素(CH)62.5 mg/kg,每日1次;正常對照組行假照射(鉛磚屏蔽),于第4、5、6天腹腔注射等體積生理鹽水。第7天,隨機抽查造模小鼠外周血象、骨髓象,驗證成模。

        1.5.2 分組與處理 選取健康ICR小鼠105只,適應性喂養(yǎng)7 d,按隨機數(shù)字表法隨機選出15只設為正常對照組,其余隨機分為6組(模型組、西藥對照環(huán)孢素組、中藥對照雷公藤多苷組、中藥治療高劑量組、中藥治療中劑量組、中藥治療低劑量組),每組15只。分別為:1)正常對照組、模型組灌胃生理鹽水,每次0.2 mL,每日1次。2)西藥對照組:成模后予以環(huán)孢素軟膠囊23.5 mg/(kg·d),灌胃,每日1次。3)中藥對照組:成模后予以雷公藤多苷9.36mg/(kg·d),灌胃,每日1次。4)低劑量組:成模后予以薯蕷皂苷37.44 mg/(kg·d),灌胃,每日1次。5)中劑量組:成模后予以薯蕷皂苷74.88 mg/(kg·d),灌胃,每日1次。6)高劑量組:成模后予以薯蕷皂苷149.76mg/(kg·d),灌胃,每日1次。第7~14天,各組連續(xù)灌胃,第15天定為取材時間。

        各組用藥參照成人劑量:環(huán)孢素軟膠囊150mg/d,雷公藤多苷片60 mg/d,薯蕷皂苷片低、中、高劑量分別為240,480,960 mg/d。參考陳奇《中藥藥理研究方法學》,按照“動物體表面積比率換算等效劑量法”計算小鼠給藥量。

        1.5.3 小鼠骨髓單個核細胞(BMMNC)分離培養(yǎng)治療后第15天,斷頸處死小鼠,無菌條件下取雙側股骨,用帶有5號針頭的5 mL注射器吸取RPMI1640培養(yǎng)液,反復沖洗骨髓腔,將骨髓細胞收集在滅菌離心管內,并反復吹打,使骨髓細胞充分分散,制成懸液。將充分混勻的細胞懸液以1∶1比例加在淋巴細胞分離液的表面上,離心2 000 r/min,10 min,分離出單個核細胞層,移入1個5 mL離心管內。加入磷酸鹽緩沖液(PBS)2 mL,反復吹打,離心1 000 r/min,10 min,去上清液,洗兩次。用3mL1640培養(yǎng)液(青霉素0.073 7g/L、鏈霉素0.171 7g/L,碳酸氫鈉2g/L,10%胎牛血清)懸浮沉淀細胞,制成懸液計數(shù),經(jīng)臺盼藍鑒定細胞活性在95%以上,將懸液移入25 mL培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%二氧化碳(CO2)飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后細胞消化后吸取移入離心管中,離心1000r/min,10min。收集培養(yǎng)上清液及BMMNC,流式細胞儀檢測。

        1.5.4 骨髓CD3+、CD4+、CD8+檢測 將上述培養(yǎng)后的細胞吹打后移入離心管中,制成骨髓單個核細胞懸液,將細胞濃度調至 1×106細胞/mL。取懸液 100 μL,分別加入免疫熒光抗體FITC anti-mouseCD31 μL、PE/Cy5anti-mouseCD41μL、PEanti-mouseCD8a1μL。4℃,避光孵育 30min,PBS(7.2~7.4)緩沖液洗滌 2 次,離心,1 000 r/min,5 min,棄上清液,補足0.5 mL PBS,上流式細胞儀檢測、分析,設立陰性對照。

        2 結果

        2.1 各組外周血血象比較 見表1。

        表1 治療后各組外周血細胞計數(shù)s)

        表1 治療后各組外周血細胞計數(shù)s)

        注:與正常組比*P<0.05;與模型組比△P<0.05;與CsA組▲P<0.05;與雷公藤組比▲▲P<0.05。

        組別 n 白細胞(×109) 血紅蛋白(g/L) 血小板(×109)正常組 15 13.50±3.36 172.50±41.62 800.30±36.94模型組 10 1.57±0.40 77.47±10.71 268.73±29.38低劑量組 11 5.76±0.70*△▲ 100.70± 5.67*△▲ 441.70±43.47*△▲中劑量組 12 11.97±2.02△▲▲ 139.08±11.70△▲▲ 730.08±99.6△▲▲高劑量組 11 8.72±2.15*△▲▲114.60± 4.95*△▲▲651.50±45.24*△▲▲Cs A 組 11 8.86±1.49 115.91± 5.20 529.45±30.42雷公藤組 10 5.69±1.21 98.64± 7.09 412.18±39.98

        治療后各治療組與模型組、正常對照組比較差異均有顯著性。穿龍薯蕷皂苷低、中、高3組組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),以中劑量組最優(yōu)。其與兩者陽性藥物對照組比較均具有顯著差異(P<0.05)。

        2.2 再障小鼠骨髓象比較 正常對照組骨髓增生活躍,骨髓小粒造血細胞豐富。模型組骨髓粒系、紅系、巨核系三系增生減低,骨髓非造血細胞較多。治療后各組骨髓增生比較活躍,骨髓小粒造血細胞不同程度恢復,穿龍薯蕷皂苷中劑量組優(yōu)于低、高劑量組及各陽性對照組。

        2.3 各組小鼠骨髓CD3+、CD4+、CD8+檢測 見表2。

        表2 小鼠骨髓 CD3+、CD4+、CD8+表達(±s)%

        表2 小鼠骨髓 CD3+、CD4+、CD8+表達(±s)%

        注:與正常組比較*P<0.05,與模型組比較△P<0.05,與CsA組比較▲P<0.05,與雷公藤組比較▲▲P<0.05。

        組別 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+正常組 74.6±2.29 49.54±1.66 25.87±1.91 1.71±0.17模型組 60.42±1.40* 39.26±1.89* 39.76±1.61* 1.06±0.25*低劑量組 65.57±2.13*△ 43.94±1.30*△ 38.26±1.14* 1.13±0.11*中劑量組 73.18±1.50△▲▲ 49.82±1.70△▲▲26.02±1.83△▲▲1.80±0.27△▲▲高劑量組 72.99±1.87△▲▲ 47.98±1.38△▲▲37.17±2.31* 1.26±0.21*CsA 組 68.23±1.32*△ 44.67±1.68*△ 36.93±1.46* 1.16±0.24*雷公藤組 62.84±0.92*△ 43.55±1.50*△ 37.81±2.03* 1.15±0.13*

        CD3+和CD4+表達模型組低于正常組(P<0.05),CD8+表達模型組高于正常組(P<0.05),治療各組與模型組相比均有差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中中、高劑量組與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),中、高劑量組與兩陽性對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

        CD4+/CD8+比值:模型組低于正常組(P<0.05),中劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),治療組與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

        3 討論

        根據(jù)再障的發(fā)病特點及臨床表現(xiàn),中醫(yī)學可將其歸屬于“虛勞”、“血虛”、“血證”等范疇,中醫(yī)認為“腎主骨,生髓”、“血者水谷之精也,生化于脾”,認為病機以脾腎為本,尤與腎關系密切,病機關鍵在于“腎虛”,補腎治療是中醫(yī)藥治療再障的重要法則,但又因其病程遷延,日久難愈,固有“久病必瘀”之說,研究表明中藥穿龍薯蕷有化痰活血之功效,并有免疫調節(jié)作用。故筆者應用穿龍薯蕷皂苷治療再障小鼠,以觀察其療效,探討其免疫作用機制。

        T淋巴細胞亞群是機體免疫系統(tǒng)中主要的調節(jié)因子及效應細胞,它可通過對抗原識別、處理、遞呈等引起多種細胞因子同多種細胞之間的網(wǎng)絡聯(lián)系,從而構成維持機體免疫功能的生理狀態(tài)。參與免疫應答的主要T細胞為CD3+、CD4+和CD8+細胞。

        本實驗研究結果顯示再障模型組小鼠骨髓CD3+、CD4+的表達明顯低于正常對照組(P<0.05),CD8+的表達高于正常對照組,CD4+/CD8+比值顯著低于正常對照組。給予穿龍薯蕷皂苷治療后,低、中、高劑量組CD3+、CD4+的表達以及CD4+/CD8+比值明顯高于模型組(P<0.05),且中、高劑量組與陽性對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明穿龍薯蕷皂苷能調節(jié)提高再障小鼠骨髓CD3+、CD4+的表達,抑制小鼠骨髓CD8+的表達,促進CD4+/CD8+比值的恢復,從而抑制骨髓T細胞的異常激活,促進骨髓造血功能的恢復。

        [1]徐淑芬,白 海,王存邦,等.再生障礙性貧血患者骨髓T細胞亞群與免疫抑制治療療效的關系[J].西北國防醫(yī)學雜志,2010,31(6):401-403.

        [2]江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典[M].上海:上海人民出版社,1977:1726.

        [3]于海榮,工濟興,陳建雙,等.穿山龍總皂昔含藥血清對小鼠脾淋巴細胞增殖及IL-6產(chǎn)生影響的實驗研究[J].江蘇中醫(yī)藥,2007,39(1):57-58.

        [4]王濟興,張風英,宋鴻儒,等.穿山龍總皂苷對大鼠T淋巴細胞功能影響的血清藥理學研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(9):1653-1654.

        [5]舒 艷.穿龍薯蕷抗癌活性成分的研究[D].沈陽:沈陽藥科大學,2006:251.

        [6]孫紀元,王四旺,施新猷,等.再生障礙性貧血的動物模型實驗研究[J].中國實驗動物學雜志,2000,10(4):210-211.

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