任守平，張榮位，金鴻賓

300211 天津醫(yī)院創(chuàng)傷中心（金鴻賓）

如何促進骨折愈合，防止骨折延遲愈合或骨不連的發(fā)生，是當今骨科研究的重要課題之一。近年來隨著基礎(chǔ)學科的發(fā)展，有關(guān)中藥促進骨折愈合的研究工作取得了長足的進步[1]，凸顯出中醫(yī)中藥辨證施治促進骨折愈合優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與骨折模型制作 4月齡Wister大鼠64只（合格證號SCXK津2009-0001），雌雄各半，平均體質(zhì)量為（230.00±37.35）g。購入后適應性飼養(yǎng)1周，然后用烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉，無菌操作，于右脛骨結(jié)節(jié)下2 mm處由前向后以磨鉆磨除脛骨前2/3骨質(zhì)，僅保留髓腔后側(cè)皮質(zhì)骨，形成約3 mm×4 mm近橫斷骨缺損區(qū)造模，術(shù)后腹腔注射硫酸慶大霉素2天以預防感染。標準飼料常規(guī)飼養(yǎng)（由天津中醫(yī)藥大學實驗中心提供），自由攝食、飲水。

1.2 治療藥物 骨樂寧膠囊：當歸、黃芪、熟地黃、白芍、川芎、柴胡、赤芍、桃仁、紅花等組成。由天津中醫(yī)藥大學附屬北辰中醫(yī)院制劑科制作提供。每粒含生藥0.3g。

骨折挫傷膠囊：哈爾濱華雨制藥有限公司生產(chǎn)中成藥，批號ZZ-5434-黑衛(wèi)藥準字（1989）第300127號。主要成份有：紅花、大黃、當歸、乳香、沒藥、血竭、土鱉蟲、自然銅等。每粒含生藥0.29g。

1.3 分組治療與標本采集 造模后的大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為4組：骨樂寧高劑量組、骨樂寧低劑量組、骨折挫傷膠囊組、空白對照組，每組16只。按人與大鼠體質(zhì)量換算系數(shù)5.1計算，骨樂寧高劑量組用量為0.55mg/（g·d），骨樂寧低劑量組為0.30 mg/（g·d），骨折挫傷膠囊劑量為0.46 mg/（g·d）。造模術(shù)后第1天起按上述用藥量的蒸餾水混懸液灌胃給藥，每日1次；空白對照組給予等容量生理鹽水灌胃。

全部實驗動物分別于治療 7、14、21、28 d 時，分4批拉頸處死，截取模型骨段，剔除脛骨周圍軟組織，20%中性福爾馬林液固定24 h，再經(jīng)脫水、脫鈣、切片、染色后觀察。

1.4 檢測方法 采用卵白素—生物素復合技術(shù)進行免疫組化染色顯示血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達陽性細胞。嚴格按照試劑盒（上海西唐生物技術(shù)公司）說明要求操作，石蠟切片脫蠟至水后，3%雙氧水（H2O2）消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，再行抗原熱修復，正常山羊血清封閉。滴加一抗、二抗等多重孵育，最后用二甲氨偶氮苯（DAB）顯色劑顯色，復染，封片。每骨切片在400倍鏡下取5個視野，統(tǒng)計每個視野中的陽性染色細胞數(shù)，再取其平均數(shù)作為個體陽性細胞統(tǒng)計數(shù)并以Image-Pro圖像處理系統(tǒng)計算其染色面積。

1.5 統(tǒng)計學處理 全部數(shù)據(jù)用SPSS 11.0進行統(tǒng)計分析，組間差異采用兩樣本均數(shù)的t檢驗進行判斷，P＜0.05，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果采用均數(shù)±標準差表示（±s）。

2 結(jié)果

骨折模型在不同時點骨痂中VEGF的表達。染色結(jié)果顯示在骨小梁及成骨細胞中著色，細胞漿呈棕黃色顆粒樣改變，而細胞核呈淡藍色，深棕黃色者為強陽性，淺黃色者為弱陽性，無著色顆粒者為陰性?？梢钥闯鯲EGF在傷后第7天時即已有表達，但僅在少數(shù)成骨細胞、內(nèi)皮細胞等細胞中；第14天時達到峰值，在血管內(nèi)皮細胞、軟骨細胞及成骨細胞均為強陽性表達，第28天時陽性表達細胞數(shù)明顯減少。這一過程在相應的陽性細胞染色面積統(tǒng)計上表現(xiàn)得更為突出，且與相關(guān)研究具有一致性[2-3]?？傮w在4個檢測時點的骨痂切片中骨樂寧膠囊高劑量組VEGF表達較其他各組強，空白對照組表達最弱，見表1和表2。

表1 骨痂切片VEGF染色陽性細胞計數(shù)（±s） 個/視野

表1 骨痂切片VEGF染色陽性細胞計數(shù)（±s） 個/視野

注：與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01，與骨折挫傷組比較：#P<0.05。

組別 n 7 d 14 d 21 d 28 d骨樂寧高 15 32.90±3.4 59.20±5.5**50.00±3.1*# 27.50±0.3骨樂寧低 16 27.10±2.9 43.70±3.0 39.50±4.2 22.70±1.9骨折挫傷 16 29.20±4.2 48.80±1.7* 36.80±4.3 21.80±2.2空白對照 14 22.20±3.0 36.80±2.5 34.00±3.9 20.90±2.6

3 討論

人體氣血循行于周身，外而營養(yǎng)皮肉筋骨，內(nèi)而灌溉五臟六腑。故當肢體受跌撲打擊外傷之時，皮肉筋骨雖首當其沖的同時必然傷及氣血，外而為腫為痛，內(nèi)而臟腑功能失調(diào)。正如《正體類要》序中所指出“肢體損傷于外則氣血傷于內(nèi)，營衛(wèi)有所不貫，臟腑由之不和”。血瘀氣滯所致的傷處腫痛實乃外傷之標，而氣血臟腑功能失和才是傷病之本。治療則需氣血標本兼顧。有實驗研究證明中藥在骨折愈合的不同階段有著不同的作用及機制，過多使用活血化瘀藥可破壞骨折愈合自身相對穩(wěn)定的血氧代償機制，不利于新生血管的形成從而影響骨折愈合。骨樂寧膠囊立方旨在通過益氣活血以達到瘀去新生促進骨折愈合的目的。

表2 骨痂切片VEGF染色陽性細胞面積（±s）

表2 骨痂切片VEGF染色陽性細胞面積（±s）

注：與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01，與骨折挫傷組比較：#P<0.05，##P<0.01。

×10-10m2/視野組別 n 7 d 14 d 21 d 28 d骨樂寧高 15 131.5±23.4**205.6±30.2**##174.6±18.2*#91.7± 9.6骨樂寧低 16 110.8±11.7 145.9±21.4 135.9± 9.7 78.9±14.1骨折挫傷 16 118.5±17.3* 159.9±14.3* 129.7±12.5 74.6±12.1空白對照 14 86.3±14.8 125.1±23.4 116.5±14.4 70.3±11.8

[1]任守平，金鴻賓.中藥對骨折愈合相關(guān)細胞因子作用的研究進展[J].天津中醫(yī)藥，2010，26（6）：527－529.

[2]初同偉，王正國，朱佩芳，等.血管內(nèi)皮生長因子在骨折愈合中的作用[J].中國修復重建外科雜志，2002，16（2）：75.

[3]任守平，金鴻賓.骨樂寧膠囊早期促進骨折愈合的臨床研究[J].天津中醫(yī)藥，2010，26（4）：323－324.