梁允蘭 史海波

脂聯(lián)素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，研究證實脂聯(lián)素與胰島素抵抗密切相關(guān)，具有抗動脈粥樣硬化(AS)形成、抗炎癥和損傷后抗內(nèi)膜增生的特性。脂聯(lián)素基因全長17 kb，定位于3q27，全基因組掃描顯示該區(qū)域存在2型糖尿病、代謝綜合征和冠心病的易感位點［1－2］，因此成為糖尿病和冠心病的研究熱點。國內(nèi)外研究表明脂聯(lián)素在冠心病的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，劉巖等［3］發(fā)現(xiàn)血漿脂聯(lián)素水平與冠狀動脈粥樣硬化的狹窄程度呈逆相關(guān)，并隨AS的發(fā)展呈進(jìn)行性下降，低脂聯(lián)素血癥是冠狀動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志，是AS發(fā)生、發(fā)展的獨立危險因素;Nakamura等［4］研究發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征(ACS)患者脂聯(lián)素水平要比穩(wěn)定型心絞痛患者更低，脂聯(lián)素可用于冠心病的危險評估。因脂聯(lián)素基因區(qū)域有較大頻率的基因多態(tài)性，因此對定位于染色體3q27區(qū)域的人基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與疾病的關(guān)系已經(jīng)成為近年來的關(guān)注熱點。國外近來已有脂聯(lián)素基因SNPs與冠心病相關(guān)性的研究［5］，但脂聯(lián)素基因SNPs與急性心肌梗死(AMI)的相關(guān)性研究在中國人群中的研究少見。脂聯(lián)素基因內(nèi)存在14個SNPs，本研究在中國人群中檢測脂聯(lián)素基因外顯子SNP+45和內(nèi)含子SNP+276基因多態(tài)性并探討這2個SNPs與AMI的相關(guān)關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 AMI組78例，為2005年8月至2006年2月住院病人，根據(jù)臨床表現(xiàn)及冠狀動脈造影證實為AMI患者，其中男59例，女19例，年齡39～84歲，平均(46.0±10.8)歲;對照組84例來自健康體檢結(jié)果正常者，其中男66例，女17例，年齡36～69歲，平均(42.6±10.6)歲，排除心臟病、高血壓、高血糖、高血脂等病史。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑:TGL－16B型高速臺式離心機(jī)，DK－8D型電熱恒溫水槽，PTC－100型PCR儀(美國MJ公司)和移液器(德國Eppendorf公司)，DFD型電泳儀(北京東方特力科貿(mào)公司)，Multiscan100ES型凝膠成像系統(tǒng)(美國基因公司)。瓊脂糖、溴化乙錠(EB)、引物(上海英駿生物)、TaqDNA聚合酶和 DNAmarker(Takara公司)、dNTPs和限制性內(nèi)切酶RcaI及BsmaI(晶美公司)。

1.2.2 樣本采集與DNA提取:抽取AMI組及對照組受試者晨起空腹靜脈血3 ml，肝素鈉抗凝，美國Promaga公司全血提取基因組DNA試劑盒提取新鮮血基因組DNA，－20℃長期保存。

1.2.3 SNPs分析:PCR擴(kuò)增上游引物:5'－CTTGGTGAGGAAAGGAGAC－3';下游引物:5'－GAGGAA2TCAGAATATGAATG－3'。PCR 反應(yīng)體系20 μl中包括含提取 DNA 模板 1.5 μl、10 × Buffer 2.0 μl、25 mmol/L MgCl21.2 μl、Taq 酶 0.2 μl、25 mmol/L dNTP 0.4 μl、10 μmol/L 引物各0.4 μl，雙蒸水補(bǔ)足至20 μl，置 PCR儀中。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min計2個循環(huán)然后進(jìn)入主循環(huán):94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min共40個循環(huán)，末次延伸72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物為745 bp，上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別以RcaI 37℃，BsmI 65℃酶切過夜，然后用1.5%瓊脂糖電泳，以50～2000 bp的DNA marker為參照物，EB染色后紫外線檢測SNP+45及SNP+276基因型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，2組間比較行t檢驗。計數(shù)資料以百分比表示，基因型或等位基因不同分組之間的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1 SNP+45位點經(jīng)RCaI酶切后產(chǎn)生3種基因型，分別為:野生型(TT)、雜合子型(TG)、純合子突變型(GG)，包含G等位基因的745 bp片段不被RCaI酶切，不含G等位基因的片段被酶切為453 bp和292 bp的2個片段。野生型(TT)顯示2根條帶(453 bp和292 bp)，雜合子型(TG)顯示3根條帶(745 bp、453 bp和292 bp)，純合子突變型(GG)顯示1根條帶(745 bp)。見圖1。

圖1 脂聯(lián)素基因SNP+45電泳結(jié)果

2.1.2 SNP+276位點經(jīng)BSmI酶切后產(chǎn)生3種基因型，分別為:野生型(TT)、雜合子型(GT)、純合子突變型(GG)，包含G等位基因的745 bp片段不被BSmI酶切，不含G等位基因的片段被酶切為523 bp和222 bp的2個片段。野生型(TT)顯示2根條帶(523 bp和222 bp)，雜合子型(GT)顯示3根條帶(745 bp，523 bp和222 bp)，純合子突變型(GG)顯示1根條帶(745 bp)。見圖2。

2.2 AMI組和對照組基因型頻率及等位基因頻率比較

圖2 脂聯(lián)素基因SNP+276電泳結(jié)果

2.2.1 AMI組和對照組脂聯(lián)素基因SNP+276基因型分布有顯著性差異(P＜0.05)，AMI組GG+GT基因型分布頻率高于對照組，而TT基因型在對照組分布頻率高于AMI組;等位基因頻率未見顯著性差異。見表1。脂聯(lián)素基因SNP+45基因型分布和等位基因頻率2組間未見顯著性差異。見表2。

2.2.2 AMI組中脂聯(lián)素基因SNP+276中GG+GT基因型血糖濃度顯著高于TT基因型(P＜0.05);AMI組脂聯(lián)素基因SNP+45為GG基因型者膽固醇濃度高于TG和TT基因型，有顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

表1 AMI組與對照組脂聯(lián)素SNP+276基因頻率比較(n，%)

表2 AMI組與對照組脂聯(lián)素SNP+45基因頻率比較(n，%)

表3 脂聯(lián)素SNP+45、SNP+276不同基因型與AMI組血糖和膽固醇濃度的關(guān)系(±s，mmol/L)

表3 脂聯(lián)素SNP+45、SNP+276不同基因型與AMI組血糖和膽固醇濃度的關(guān)系(±s，mmol/L)

注:由于SNP+276為GG型者頻率較低，因此與GT基因型合為一組進(jìn)行統(tǒng)計。與SNP+45 GG基因型比較，*P＜0.05;與SNP+276 TT基因型比較，△P＜0.05

指標(biāo)SNP+45 SNP+276 GG基因型 TT基因型 TG基因型 GG+GT基因型 TT基因型(n＝10) (n＝30) (n＝38) (n＝48) (n＝30)血糖 6.76±2.16 7.98±5.17 7.91±4.52 8.68±5.34△6.16±1.31膽固醇 5.26±1.27 4.28±0.97* 4.41±0.97*4.42±1.23 4.56±0.98

3 討論

脂聯(lián)素是脂肪組織特異性分泌的激素樣蛋白質(zhì)，許多研究已經(jīng)證實脂聯(lián)素具有抑制巨噬細(xì)胞對膽固醇酯的攝取，減少巨噬細(xì)胞表面清道夫受體基因的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞(SMC)的增殖、分化及向皮下?lián)p傷區(qū)的遷移，抑制SMC向內(nèi)膜的遷移和增殖，同時還能促進(jìn)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)。而內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和SMC正是構(gòu)成AS灶的三要素。因此脂聯(lián)素與冠心病之間必然存在重要的密切聯(lián)系。黃繼良等［7］研究顯示老年冠心病患者較對照組血清脂聯(lián)素水平明顯降低，且隨頸動脈狹窄程度加重，脂聯(lián)素水平進(jìn)行性下降，中度和重度組患者血清脂聯(lián)素水平明顯低于輕度患者，但中度和重度組患者血清水平差異無顯著性，表明脂聯(lián)素在由輕度頸動脈狹窄向中、重度頸動脈狹窄發(fā)展的過程中起了較重要作用，而重度頸動脈狹窄的發(fā)生可能是在脂聯(lián)素水平下降的基礎(chǔ)上，多種因素綜合作用的結(jié)果。

1996年，Maeda等［8］克隆了人脂聯(lián)素基因，目前已知人脂聯(lián)素基因是單拷貝基因，全長17 kb，位于3q27，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子。脂聯(lián)素基因內(nèi)存在14個SNPs，本研究在中國人群中檢測SNP+45(T/G)和 SNP+276(G/T)，并探討這兩個 SNPs與AMI的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示AMI組和對照組脂聯(lián)素基因SNP+276三種基因型分布有顯著性差異(P＜0.05)，AMI組GG+GT基因型分布頻率高于對照組。與Filippi等［6］研究結(jié)果相似:脂聯(lián)素基因SNP+276 G＞T與冠心病有顯著的相關(guān)性，多變量分析顯示攜帶有此基因的人患冠心病的概率增加，并與年齡明顯相關(guān)(OR＝1.03，P＜0.0001);在早發(fā)的冠心病的患者中攜帶有SNP+276 G＞T者，脂聯(lián)素水平明顯降低。該研究認(rèn)為脂聯(lián)素基因的變異或突變決定著低脂聯(lián)素基因表達(dá)，導(dǎo)致動脈粥樣硬化(AS)及心血管疾病的發(fā)生。脂聯(lián)素內(nèi)含子2 SNP+276 G/T則遠(yuǎn)離剪切位點，其調(diào)節(jié)RNA水平的確切機(jī)制不甚清楚，可能是與不同等位基因造成的不同寡核苷酸轉(zhuǎn)錄文本與轉(zhuǎn)錄因子的親和力不同有關(guān)。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)AMI組脂聯(lián)素基因SNP+276中GG+GT基因型血糖濃度高于TT基因型，與國內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果相似［9］:脂聯(lián)素基因SNP+276 GG+GT基因型與HOMA－IR顯著正相關(guān)(P＜0.005)。因此我們認(rèn)為:SNP+276不僅與AMI直接相關(guān)，而且與AMI的危險因素相關(guān)。

本研究結(jié)果雖顯示脂聯(lián)素基因SNP+45基因型分布和等位基因頻率2組間未見顯著性差異，但AMI組中脂聯(lián)素SNP+45各基因型膽固醇濃度有顯著性差異(P＜0.05)，GG基因型膽固醇濃度高于GT和TT型。與一項法國肥胖人群研究結(jié)果相同，SNP+45 T/G與血清膽固醇相關(guān)［10］外顯子2 SNP+45 T/G屬于同義突變G15G，由于位置靠近外顯子和內(nèi)含子的連接部位，故這一編碼區(qū)的靜止突變可能是通過影響mRNA的剪切機(jī)制來影響APM21基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)RNA水平。

脂聯(lián)素參與AS形成的各個環(huán)節(jié)，通過多種作用機(jī)制抑制血管的炎癥反應(yīng)阻斷AS的形成，發(fā)揮其抗AS作用。雖然目前為止脂聯(lián)素抗AS的確切作用機(jī)制尚不明確，但是體內(nèi)體外實驗已證實，補(bǔ)充脂聯(lián)素可有效防止或抑制AS的形成，因此有望成為防治AS的有效治療手段。

［1］Kissebah AH，Sonnenberg GE，Myklebust J，et al.Quantitative trait loci on chromosomes 3 and 17 influence phenotypes of the metabolic syndrome［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(26):14478－14483.

［2］Francke S，Manraj M，Lacquemant C，et al.A genome－wide scan for coronary heart disease suggests in Indo－Mauritians a susceptibility locus on chromosome 16p13 and replicates linkage with the metabolic syndrome on 3q27 ［J］.Hum Mol Genet，2001，10(24):2751－2765.

［3］劉巖，鄒大進(jìn)，李慧，等.低脂聯(lián)素血癥是冠狀動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2005，21(1):5－8.

［4］Nakamura Y，Shimada K，F(xiàn)ukuda D，et al.Implications of plasma concentrations of adiponectin in patients with coronary artery disease［J］.Heart，2004，90(5):528－533.

［5］Filippi E，Sentinelli F，Romeo S，et al.The adiponectin gene SNP+276 G ＞ T associates with early－onset coronary artery disease and withlower levels of adiponectin in younger coronary artery disease patients(age＜o(jì)r＝50 years)［J］.J Mol Med，2005，83(9):711－719.

［6］黃繼良，劉曉君，高燕，等.冠心病者頸動脈內(nèi)膜中層厚度與血清脂聯(lián)素水平相關(guān)性［J］.實用老年醫(yī)學(xué)，2006，20(1):27－29.

［7］Maeda K，Okubo AK，Shimomura I，et al.cDNA cloning and expression of a novel adipose specific collagen－like factor，APM1(Adipose Most Abundant Gene Transcrip 1)［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，221(2):286－289.

［8］汝穎，馬猛，馬騰，等.脂聯(lián)素基因SNP276多態(tài)性與冠心病及胰島素敏感性的相關(guān)性［J］.中國循環(huán)雜志，2005，20(5):332－335.

［9］Fumeron F，Aubert R，Siddiq A，et al.Adiponectin genepolymorphisms and adiponectin levels are independently associated with the development of hyperglycemia durina 3－year period:the epidemiologic data on the insulin resistance syndrome prospective study［J］.Diabetes，2004，53(4):1150－1157.