石曉明 檀碧波 劉學(xué)軍 韓 杰

(河北省人民醫(yī)院胃腸外科，河北 石家莊 050051)

化療是結(jié)腸癌綜合治療的重要措施，而腫瘤多藥耐藥(MDR)的存在常導(dǎo)致化療失敗，探討MDR機(jī)制并尋找逆轉(zhuǎn)靶點(diǎn)已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。由于腫瘤進(jìn)展過(guò)程中產(chǎn)生的亞克隆變化將使腫瘤在許多細(xì)胞學(xué)特性(包括MDR等方面)發(fā)生異質(zhì)變化〔1，2〕，故進(jìn)展期結(jié)腸癌切除術(shù)后化療的目標(biāo)應(yīng)針對(duì)轉(zhuǎn)移灶和/或殘留病灶。P-糖蛋白(P-gp)的藥泵作用和Bcl-2、Bax參與的凋亡調(diào)控途徑在目前結(jié)腸癌MDR研究中受關(guān)注最多，但關(guān)于結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶P-gp、Bcl-2、Bax表達(dá)與化療藥敏性關(guān)系的報(bào)道尚罕見。本研究旨在探討結(jié)腸癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)P-gp、Bcl-2、Bax表達(dá)與腫瘤細(xì)胞體外化療藥物敏感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 2006年10月至2009年2月在我院手術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌48例，其中男26例，女22例，年齡36～80〔平均(64.5±14.54)〕歲。所有病例術(shù)前均未接受放化療。每例腫瘤原發(fā)灶、相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本均經(jīng)中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色病理診斷。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色法測(cè)定 P-gp、Bcl-2、Bax表達(dá) 鼠抗人P-gp、Bcl-2、Bax單克隆抗體及免疫組化試劑盒均購(gòu)自北京中杉生物公司(美國(guó)，ZYMED公司產(chǎn)品)，采用SP法分別對(duì)腫瘤原發(fā)灶與陽(yáng)性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)進(jìn)行上述指標(biāo)免疫組化染色，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。由兩位病理醫(yī)師分別雙盲閱片進(jìn)行結(jié)果判斷。每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍(400倍)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，三種蛋白均以細(xì)胞膜及(或)細(xì)胞質(zhì)著染呈黃色為陽(yáng)性，按腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率分別記分。著色強(qiáng)度記分:無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞率記分標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，≥76%為4分;兩種記分標(biāo)準(zhǔn)所得分值的乘積為0或1為陰性(－)，2～3為弱陽(yáng)性(+)，4～7陽(yáng)性(?)，≥8強(qiáng)陽(yáng)性(?)。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及化療藥敏性試驗(yàn) 術(shù)中標(biāo)本離體后分別取新鮮腫瘤組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)1～2枚各1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm置入雙抗(青霉素G鈉100 U/ml、鏈霉素200μg/ml)培養(yǎng)液，2 h內(nèi)行原代細(xì)胞培養(yǎng)化療藥物敏感實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)為術(shù)中清掃的可疑腫大淋巴結(jié)中切取少許組織，冰凍切片診斷并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。腫瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織經(jīng)研磨分散，用細(xì)胞分離器調(diào)細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/ml。培養(yǎng)前將腫瘤藥敏檢測(cè)板和DMEM培養(yǎng)基預(yù)溫至37℃。10種受試藥物為5-氟尿嘧啶(5-FU)、足葉乙甙(VP-16)、羥基喜樹堿(HCPT)、紫杉醇(PTX)、奧沙利鉑(L-OHP)、順鉑(CDDP)、表阿霉素(eADM)、吡喃阿霉素(THP)、絲裂霉素(MMC)、長(zhǎng)春新堿(VCR)，藥物終濃度為血漿峰值藥物濃度〔2〕。每種藥物設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)不加藥物的細(xì)胞對(duì)照組。接種細(xì)胞懸液200μl/孔，微量振蕩器振蕩混勻，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 h，加四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(5 mg/ml)20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)3～24 h，終止培養(yǎng)時(shí)間為顯微鏡下觀察MTT還原形成藍(lán)色針狀結(jié)晶。將細(xì)胞培養(yǎng)板1 000 r/min離心10 min，棄上清，吸水紙吸去殘留液體。加入DMSO 100μl/孔，輕輕振蕩混勻，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)各孔A值。腫瘤細(xì)胞平均抑制率(IR)=(1－給藥孔平均A值/對(duì)照孔平均A值)×100%。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)，等級(jí)資料使用Wilcoxon配對(duì)秩和檢驗(yàn)、雙變量相關(guān)分析并計(jì)算Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶耐藥相關(guān)因子表達(dá)強(qiáng)度比較 經(jīng)Wilcoxon配對(duì)秩和檢驗(yàn)，P-gp、Bax在轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)程度明顯高于原發(fā)灶(S=160.5，P＜0.001;S=111.0，P=0.021)，而Bcl-2在原發(fā)灶中表達(dá)強(qiáng)于轉(zhuǎn)移灶(S=－176.5，P=0.003)。雙變量相關(guān)分析顯示，在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)間P-gp、Bax表達(dá)具有明顯正相關(guān)性(r=0.660 6，P＜0.001;r=0.399 5，P=0.004 9);而Bcl-2表達(dá)在原發(fā)腫瘤與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶間無(wú)明顯相關(guān)性。見表1。

2.2 結(jié)腸癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶化療藥敏試驗(yàn)結(jié)果 10種常用化療藥物對(duì)原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞的平均抑制率不同。原發(fā)灶順序依次為 PTX＞VCR＞L-OHP＞5-FU ＞HCPT＞CDDP＞eADM＞VP-16＞THP＞MMC;轉(zhuǎn)移灶順序依次為PTX＞5-FU＞eADM＞VP-16＞L-OHP ＞HCPT＞THP＞CDDP ＞VCR ＞MMC。其中5-FU、VP-16、THP、MMC 對(duì)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)腫瘤細(xì)胞的抑制率高于原發(fā)灶;HCPT、L-OHP、CDDP、VCR對(duì)原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞抑制率高于轉(zhuǎn)移灶;PTX、eADM對(duì)兩種組織腫瘤細(xì)胞的抑制率無(wú)明顯差異。5-FU、HCPT、L-OHP、MMC、VCR對(duì)原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶二者間腫瘤細(xì)胞抑制率具正相關(guān)性(r=0.293 1～0.384 1，均P＜0.05)，5種藥物對(duì)原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞抑制率均有顯著性差異(均P＜0.05);而VP-16、PTX、CDDP、eADM、THP對(duì)原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞抑制率無(wú)明顯相關(guān)性(均P＞0.05)。見表2。

表1 結(jié)腸癌原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中耐藥相關(guān)因子表達(dá)(n)

2.3 結(jié)腸癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中P-gp、Bcl-2、Bax表達(dá)與化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率的關(guān)系 在腫瘤原發(fā)灶，P-gp表達(dá)程度與5-FU、VCR、PTX、VP-16對(duì)腫瘤細(xì)胞的平均抑制率均呈負(fù)相關(guān)(r= －0.287 8，P=0.047 3;r= －0.337 6，P=0.018 9;r= － 0.358 2，P=0.012 4，r= － 0.445 0，P=0.001 5);在轉(zhuǎn)移灶中，P-gp表達(dá)程度與PTX、eADM對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率均具有負(fù)相關(guān)性(r=－0.367 2，P=0.010 2;r=－0.438 6，P=0.001 8)。原發(fā)灶Bcl-2表達(dá)程度與5-FU、PTX、MMC的抑制率呈負(fù)相關(guān)(r=－0.523 6，P＜0.001;r=－0.326 8，P=0.023 4;r= －0.305 2，P=0.034 9)，轉(zhuǎn)移灶Bcl-2表達(dá)程度則與HCPT、PTX、L-OHP、eADM的抑制率均具有負(fù)相關(guān)性(r= －0.322 4，P=0.025 4;r= －0.400 8，P=0.005;r= －0.515 2，P ＜0.001，r= －0.545 0，P ＜0.001)。原發(fā)、轉(zhuǎn)移灶中P-gp、Bcl-2表達(dá)與藥物抑制率均未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的正相關(guān)(均P＞0.05)。在腫瘤原發(fā)灶，Bax表達(dá)程度與5-FU、VP-16對(duì)腫瘤細(xì)胞的平均抑制率均呈正相關(guān)(r=0.306 8，P=0.033 9;r=0.485 0，P=0.000 47，均 P ＜0.05);在轉(zhuǎn)移灶中，Bax表達(dá)程度與CDDP、L-OHP、eADM對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率均具有正相關(guān)性(r=0.301 2，P=0.0375;r=0.4228，P=0.002 76;r=0.468 6，P=0.000 8)。

表2 10種藥物對(duì)原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞的抑制率(%，x±s)

3 討論

研究表明，結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗是普遍現(xiàn)象，且結(jié)腸癌對(duì)大多數(shù)化療藥物的耐藥性較胃癌更高〔3，4〕。本研究也顯示，10種常用化療藥物除PTX外，大多數(shù)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率均在40%以下，說(shuō)明結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物確存在原發(fā)性MDR。

由于結(jié)腸腫瘤切除后復(fù)發(fā)的根源是殘留和/或轉(zhuǎn)移灶，而其在腫瘤演進(jìn)過(guò)程中，不同的細(xì)胞亞群在諸多細(xì)胞學(xué)特性包括對(duì)化療藥物敏感性方面將發(fā)生基因或大分子改變。這種MDR異質(zhì)性變化包括轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞與原發(fā)灶相比在藥敏性和MDR相關(guān)因子表達(dá)方面的改變。本研究中8/10種化療藥物對(duì)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)腫瘤細(xì)胞的抑制率并不一致，僅PTX、eADM對(duì)兩種組織腫瘤細(xì)胞的抑制率無(wú)明顯差異，證實(shí)化療藥敏性在兩種組織中存在差異，以原發(fā)灶藥敏性結(jié)果預(yù)測(cè)化療效果并確定化療藥物是不準(zhǔn)確的。在MDR相關(guān)因子中，P-gp的藥物外排途徑是目前認(rèn)為導(dǎo)致腫瘤MDR的最重要機(jī)制〔3〕。Bcl-2和Bax則是新型的耐藥相關(guān)蛋白，可以通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡參與MDR，其中Bcl-2為重要的凋亡抑制蛋白，可通過(guò)多種途徑抑制凋亡而導(dǎo)致MDR〔5，6〕。Bax作為促凋亡蛋白主要通過(guò)抑制Bcl-2的活性而使凋亡易于發(fā)生〔7〕。Bax與Bcl-2有同源性，可拮抗Bcl-2，起促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2與Bax結(jié)合，形成Bcl-2/Bax異二聚體，兩者的比值決定了細(xì)胞接受調(diào)控信號(hào)后存活與否〔8〕。本研究顯示，P-gp、Bax在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)強(qiáng)度更高，且具有正相關(guān)性，說(shuō)明結(jié)腸癌在轉(zhuǎn)移過(guò)程中MDR異質(zhì)性變化可能有一定規(guī)律可循，但僅檢測(cè)原發(fā)灶的P-gp、Bax不能準(zhǔn)確反映轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)情況;轉(zhuǎn)移灶Bcl-2表達(dá)減弱也證實(shí)了MDR的異質(zhì)性變化特點(diǎn)。同時(shí)從各因子的相關(guān)分析可以看出，原發(fā)灶Bcl-2和Bax有相關(guān)性，而轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞則失去了這種相關(guān)，這可能是由于腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性變化造成Bcl-2和Bax在轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)比例進(jìn)一步失調(diào)。這些結(jié)果為腫瘤切除后開展針對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的化療提供了理論依據(jù)。

關(guān)于結(jié)腸癌MDR因子表達(dá)與化療藥敏性的關(guān)系研究尚少。本研究顯示，9/10種化療藥物對(duì)原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)腫瘤細(xì)胞的抑制率與至少一種MDR因子表達(dá)相關(guān)。原發(fā)灶中P-gp表達(dá)程度與5-FU、VCR、PTX、VP-16對(duì)腫瘤細(xì)胞的平均抑制率均呈負(fù)相關(guān);在轉(zhuǎn)移灶中，P-gp表達(dá)程度則與PTX、eADM的腫瘤細(xì)胞抑制率有負(fù)相關(guān)性。對(duì)Bcl-2的檢測(cè)顯示，原發(fā)灶與Bcl-2表達(dá)有負(fù)相關(guān)性的藥物為5-FU、PTX、MMC，而轉(zhuǎn)移灶則為HCPT、PTX、L-OHP、eADM。Bax表達(dá)強(qiáng)度在原發(fā)灶與5-FU、VP-16對(duì)腫瘤細(xì)胞的平均抑制率呈正相關(guān)，在轉(zhuǎn)移灶則隨CDDP、L-OHP、eADM抑制率升高而增強(qiáng)。這表明結(jié)腸癌中P-gp、Bcl-2、Bax表達(dá)確與腫瘤細(xì)胞MDR有一定關(guān)系，聯(lián)合檢測(cè)這3種因子在轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)對(duì)化療藥敏性預(yù)測(cè)及化療方案選擇有一定意義。但目前關(guān)于轉(zhuǎn)移灶MDR異質(zhì)性表達(dá)的機(jī)制及逆轉(zhuǎn)策略的研究尚處于起步階段，開展結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶MDR的實(shí)驗(yàn)及臨床研究以指導(dǎo)針對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的輔助化療及MDR的逆轉(zhuǎn)還需進(jìn)一步研究。

1 韓 杰，檀碧波，王安峰，等.消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶P-gp、GST-π和凋亡抑制蛋白表達(dá)的特點(diǎn)〔J〕.中華外科雜志，2009;47(2):106-8.

2 檀碧波，路紅梅，韓 杰，等.消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶體外化療藥敏性的變化及其意義〔J〕.中國(guó)普通外科雜志，2009;18(4):340-2.

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4 韓 杰，檀碧波，呂炳蓉，等.胃癌與大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)化療藥物敏感性的對(duì)比〔J〕.中華普通外科雜志，2008;23(6):464-5.

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