熊鹿言，唐海豐，余 倩

(1.上海市普陀區(qū)疾病預(yù)防控制中心，上海 200333；2.四川大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)檢教研室，四川 成都 610041)

乳酸桿菌(Lactobacillus)是人體腸道常見的益生菌之一，能幫助改善、調(diào)節(jié)人體腸道微生物菌群的平衡，降低膽固醇水平。目前，從國內(nèi)外對(duì)其在分子生物學(xué)水平的研究的情況來看，乳酸桿菌的質(zhì)粒上攜帶著多種耐藥基因，使其與臨床常見致病菌一樣，成為一個(gè)耐藥基因庫。部分學(xué)者認(rèn)為乳酸桿菌具有耐藥性是有利的，這個(gè)性質(zhì)可以避免這些對(duì)人體有益的乳酸桿菌在人們利用抗生素治療疾病的時(shí)候被一并殺滅掉。但是，這也意味著存在將這種耐藥性傳遞給外源致病菌的巨大風(fēng)險(xiǎn)，這將對(duì)臨床用藥帶來巨大的挑戰(zhàn)。本研究對(duì)不同種的乳酸桿菌進(jìn)行耐藥譜及質(zhì)粒譜層面的分析，評(píng)估人體腸道乳酸桿菌常見菌種的耐藥性，為疾病的治療提供新的思路，豐富臨床用藥的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 藥敏試驗(yàn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株（金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213）由四川大學(xué)華西醫(yī)院惠贈(zèng)；乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（嗜酸乳酸桿菌ATCC4356）V517）由四川大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)檢教研室保存；乳酸桿菌試驗(yàn)菌株、經(jīng)鑒定的正常人腸道糞便分離株，共43株，由四川大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)檢教研室保存。

1.1.2 試劑

1.1.2.1 培養(yǎng)基及試劑 MRS液體/固體培養(yǎng)基（按照《保健食品與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》自配）；改良MRS液體/固體培養(yǎng)基（在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，磷酸氫二鉀、檸檬酸三銨和硫酸鎂含量減半，去掉吐溫80和乙酸鈉）；SDS-MRS液體培養(yǎng)基（在MRS液體培養(yǎng)基中加入0.015%的SDS）；5倍TBE溶液；質(zhì)粒提取試劑盒，購于Omega公司。

1.1.2.2 抗生素標(biāo)準(zhǔn)品 八大類12種（見表1），購于中國藥品生物制品檢定所，參照文獻(xiàn)配制[1]，抗生素原液濃度為1 280 μg/ml。苯唑西林紙片購于北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.2.3 糖標(biāo)準(zhǔn)品 扁桃甙、阿拉伯糖，纖維二糖，果糖，半乳糖，葡萄糖，葡萄糖酸鹽，乳糖，麥芽糖，甘露醇，甘露糖，松三糖，蜜二糖，棉子糖，鼠李糖，核糖，柳醇，山梨醇，蔗糖，海藻糖，木糖，七葉苷，共22種，購于北京路橋技術(shù)有限公司。參見文獻(xiàn)配制糖發(fā)酵管[2-3]。

表1 43株乳酸桿菌耐藥情況（株）

1.2 方法

1.2.1 糖發(fā)酵試驗(yàn)(微量法)將乳酸桿菌從肉湯轉(zhuǎn)入MRS平板中，37℃微需氧培養(yǎng)24 h。將配制好的糖發(fā)酵試劑加入96孔板，200 μl/孔，用接種針從MRS平板上挑取適量的菌接種每孔中。37℃微需氧培養(yǎng)18～24 h后[3]觀察結(jié)果。以嗜酸乳酸桿菌ATCC4356為質(zhì)控菌，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版及《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)》的食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

1.2.2.1 微量肉湯稀釋法[1]乳酸桿菌接種MRS肉湯，37℃微需氧增菌18～20 h。參照參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行試驗(yàn)。菌液濃度調(diào)至5×105cfu/ml，使用改良MRS培養(yǎng)基進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。37℃微需氧培養(yǎng)18～24 h后，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29213為質(zhì)控，參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的非苛養(yǎng)菌常規(guī)藥敏試驗(yàn)MIC結(jié)果的解釋標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.2.2.2 K-B紙片法[1，4]乳酸桿菌接種MRS肉湯，37°C微需氧增菌18～20 h。菌液濃度調(diào)至5×105cfu/ml，使用改良MRS平板及苯唑西林藥片[5]。37℃微需氧培養(yǎng)18～24 h后，以標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923作為質(zhì)控菌株，參考CLSI推薦的非苛養(yǎng)菌常規(guī)藥敏抑菌環(huán)直徑標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.2.3 質(zhì)粒測(cè)定

1.2.3.1 質(zhì)粒的提取 乳酸桿菌接種MRS肉湯，37℃220 r/min微需氧振蕩培養(yǎng)16～18 h。取5 ml菌液，高速離心后，棄上清液，加入25 mg溶菌酶，用緩沖液重懸菌體并使其與酶混勻，37℃水浴1 h。余下操作參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書。

1.2.3.2 質(zhì)粒的測(cè)定 取10 μl質(zhì)粒提取物加入制好的0.5%瓊脂糖凝膠板中，7.5 V/cm電泳2 h，用UVI凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)菌株E.coli V517的質(zhì)粒提取物為參考，判定質(zhì)粒大小。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用秩和檢驗(yàn)對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 菌種鑒定 經(jīng)37℃微需氧培養(yǎng)，質(zhì)控菌ATCC4356糖發(fā)酵結(jié)果與嗜酸乳酸桿菌結(jié)果符合。在所測(cè)43株試驗(yàn)菌中共檢出6個(gè)菌種，含量最多的為植物乳酸桿菌L.plantarum(n=21，51.17%)，其次是干酪乳酸桿菌L.casei(n=9，20.93%)、嗜酸乳酸桿菌L.acidophilus(n=7，16.28%)和唾液乳酸桿菌L.salivarius(n=3，6.98%)，同時(shí)還檢出目前正常人腸道乳酸桿菌中尚未報(bào)道的乳酸乳桿菌L.lactis(n=2，4.65%)，賴氏乳酸桿菌L.leichmannii(n=1，2.32%)。

2.2 耐藥情況 L.casei、L.plantarum、L.salivarius和L.acidophilus是人體腸道內(nèi)常見的菌種。本文對(duì)被鑒定為上述四種菌種的乳酸桿菌進(jìn)行了藥敏分析，共43株，其耐藥情況見表1、表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)秩和檢驗(yàn)，四種菌對(duì)慶大霉素（χ2=8.773，P＜0.05）、四環(huán)素（χ2=14.659，P＜0.05）、頭孢呋辛(χ2=11.262，P＜0.05）、頭孢唑啉(χ2=13.810，P＜0.05）、利福平(χ2=12.030，P＜0.05）、羅紅霉素(χ2=12.727，P＜0.05）及紅霉素(χ2=17.886，P＜0.05)的耐藥性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)環(huán)丙沙星(χ2=0，P＞0.05）、左氟沙星(χ2=0，P＞0.05）、萬古霉素（χ2=0，P＞0.05）、青霉素(χ2=0，P＞0.05）、氨芐西林(χ2=0，P＞0.05)及苯唑西林(χ2=4.895，P＞0.05)的耐藥性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 質(zhì)粒檢出情況 43株乳酸桿菌中有40株檢出質(zhì)粒，檢出率為93%。其余菌株帶有1～6個(gè)質(zhì)粒，檢出率分別為4.65%、32.56%、20.93%、4.65%、13.95%、16.26%。共檢出20種不同大小的質(zhì)粒，其分子量范圍為1.9～85 kb，而大多數(shù)質(zhì)粒小于20 kb，具體檢出情況見表3。常見的質(zhì)粒分子量大小是54.0 kb、41.0 kb、22.0 kb和 5.8 kb，檢出率分別為60.5%、37.2%、37.2%、48.8%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)秩和檢驗(yàn)推斷，不同乳酸桿菌種的質(zhì)粒譜的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.277，P＞0.05)。

表2 43株乳酸桿菌藥敏紙片法結(jié)果（株）

表3 乳酸桿菌質(zhì)粒檢出情況

3 討 論

3.1 菌種 根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)以及其他相關(guān)報(bào)道可知，乳酸乳桿菌存在于牛奶、干酪和用于制造干酪的引子中，而賴氏乳酸桿菌多存在于壓縮酵母、谷物麥芽汁中[5]，二者并不屬于正常人腸道內(nèi)常見的菌種。這是否由于納入對(duì)象在受試前食用了含有乳酸乳桿菌和賴氏乳酸桿菌的食品所造成的，還需進(jìn)一步進(jìn)行確定。

3.2 種間的耐藥分析 本文旨在探尋乳酸桿菌種間水平的耐藥譜及質(zhì)粒譜的研究，為最終乳酸桿菌耐藥性判讀標(biāo)準(zhǔn)的制定提供數(shù)據(jù)。由于目前未見關(guān)于乳酸桿菌藥敏結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)參考的是CLSI推薦的非苛養(yǎng)菌常規(guī)藥敏標(biāo)準(zhǔn)，從表型水平、質(zhì)粒水平以及菌種水平去分析乳酸桿菌的耐藥性，豐富了關(guān)于乳桿菌耐藥性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。目前，從菌種水平去研究乳酸桿菌耐藥性的主要菌種都來自于食品、動(dòng)物及微生物制劑。Maria Rosaria D'Aimmo等[16]對(duì)從奶制品等中分離出的6株L.acidophilus及6株L.casei進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乳桿菌的兩個(gè)菌種對(duì)氨芐西林、紅霉素、青霉素、利福平都是敏感的，而對(duì)頭孢噻酚、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、萬古霉素的耐藥性與菌種相關(guān)[16]。其中萬古霉素的結(jié)果與本研究有所差異，這種差異可能是由于菌種來源不同所造成的，其他結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)是一致的。在各種來自與食品及微生物制劑的L.plantarum耐藥性的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)其對(duì)與氯霉素（耐藥率為3%）、氨芐西林（47.5%）、氯唑西林（80%）、青霉素（77.5%）、紅霉素（16%）、四環(huán)素（100%）[6-10]存在著不同程度的耐藥性。除紅霉素與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致外，青霉素、氨芐西林存在著較大的差異。Cauwerts等[11]對(duì)來自家禽雞腸道的乳酸桿菌進(jìn)行的種間水平的耐藥分析，發(fā)現(xiàn)L.salivarius帶有耐四環(huán)素(耐藥率75%)的tet（M）基因，50%的菌株帶有耐紅霉素(耐藥率 81%)的 erm(B)[12]。Marisa 等[13]曾專門針對(duì) L.acidophilus進(jìn)行耐藥研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于氨基糖苷類全耐受，對(duì)氨芐西林、氯霉素、利福平敏感、鄰氯青霉素50%敏感，四環(huán)素、紅霉素類基本耐受，對(duì)萬古霉素大部分耐受。后來Milazzo等[14]的研究再次證實(shí)L.acidophilus對(duì)氨基糖苷類抗生素全耐受。本研究結(jié)果與這些文獻(xiàn)相符，正常人腸道常見的四種菌種對(duì)萬古霉素都是耐受的。所以萬古霉素治療金黃色葡萄球菌（MRSA）感染等疾病時(shí)，不影響乳酸桿菌菌群。然而，如果乳酸桿菌成為條件致病菌發(fā)生異位，萬古霉素并不能成為抗菌藥物的最后防線，這將對(duì)臨床治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。

3.3 耐藥質(zhì)粒 據(jù)報(bào)道，大多數(shù)乳酸桿菌質(zhì)粒均為隱蔽性質(zhì)粒，其功能無法獲知。本次實(shí)驗(yàn)中雖從大多數(shù)細(xì)菌檢出質(zhì)粒，但并沒有得出質(zhì)粒譜和耐藥譜之間、質(zhì)粒譜與菌種之間的確切聯(lián)系。耐藥譜相同的菌株可能攜帶有不同數(shù)量和大小的質(zhì)粒，而質(zhì)粒圖譜相同的菌株耐藥譜可能相差很大，這證實(shí)了乳酸桿菌的耐藥性除與質(zhì)粒相關(guān)外，還與細(xì)菌的表型、環(huán)境以及來源等有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中檢出乳酸桿菌含有21種不同大小的質(zhì)粒，范圍在1.9～83 kb之間,而大多數(shù)質(zhì)粒小于20 kb。根據(jù)目前文獻(xiàn)資料，Geert等[17]研究發(fā)現(xiàn)植物乳酸桿菌中分子量為14 kb的質(zhì)粒與四環(huán)素的耐藥性有關(guān)，而在本次研究中并未檢測(cè)出14 kb的質(zhì)粒，推斷可能四環(huán)素的耐藥與其他大小的質(zhì)粒同樣有關(guān)系。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌質(zhì)粒大小在1.2～150 kb之間，絕大多數(shù)質(zhì)粒小于20.0 kb，且數(shù)量各異，本次研究與以上報(bào)道的結(jié)果相符。

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