朱旭東，毛雪冬，鄭斯齊，董襄朝，朱元元

(1.南開大學(xué)化學(xué)院，天津 300071； 2.南開大學(xué)藥學(xué)院和天津市分子藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071)

現(xiàn)代研究表明，1-脫氧野尻霉素(DNJ)可以明顯抑制食后血糖急劇升高的現(xiàn)象，延緩糖尿病的發(fā)作和惡化，對肥胖癥、病毒性感染等疾病具有顯著療效[1]。?？粕僦参锏娜~子、皮以及蠶沙中1-脫氧野尻霉素的含量較高,是臨床常用的中藥材，具有明顯的降糖作用。蠶沙作為一種養(yǎng)蠶業(yè)的副產(chǎn)物，來源廣泛，資源利用度低，目前主要用做肥料。若從其中提取DNJ成分，并制成各種降血糖中成藥及功能食品，其應(yīng)用前景十分廣闊[2]。

1 儀器和試藥

1.1儀器 SHIMADZU系列高效液相色譜儀，LC-6AD泵，CBM-20A控制器，RID-10A檢測器；DIONEX熒光檢測器；島津LCsolution工作站；KQ3200型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ALB-224電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；TGL-16G型高速臺式離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)；LGJ-0.5冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)。

1.2試藥 生藥樣品(蠶沙及桑葉)；鹽酸1-脫氧野尻霉素對照品(Sigma提供)；9-芴甲氧羰酰氯(Sigma提供)；色譜純乙腈(美國Tedia)；水為娃哈哈純凈水；硼酸、氫氧化鉀、鹽酸、甘氨酸、冰醋酸均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：YMC-Pack ODS-A色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%冰醋酸(40∶60)；流速：1.0 ml/min；熒光激發(fā)光波長為254 nm，檢測波長：322 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

分別吸取對照品溶液、空白溶液和樣品溶液各20 μl，在上述色譜條件下進(jìn)樣，即得到DNJ的測定液相色譜圖，見圖1。從圖1中可以看出，樣品中的DNJ與相鄰組分均得到良好的分離。衍生試劑的水解副產(chǎn)物FMOC-OH和Gly-FMOC均不干擾組分的測定。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液 精確稱量在-50 ℃冷凍干燥14 h的鹽酸DNJ對照品適量，加0.05 mol/L鹽酸制成30 μg/ml左右的溶液，冷藏備用。

2.2.2樣品溶液 取蠶沙適量，研細(xì)，取約1 g，精確稱量，置50 ml離心管中，精密加入0.05 mol/L鹽酸25 ml。超聲處理20 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，沉淀再加入0.05 mol/L鹽酸25 ml，超聲處理20 min[3,4]。合并2次提取液，搖勻，靜置片刻，取上清液適量，3 000 r/min離心2 min，即得。

2.2.3衍生溶液 分別精密吸取對照品溶液或樣品溶液各200 μl置2 ml量瓶中，分別精密加入0.4 mol/L K3BO3緩沖液(pH 8.5)200 μl，搖勻，加入5 mmol/L FMOC-Cl的乙腈溶液1 000 μl，搖勻，在20 ℃衍生30 min，加入0.05 mol/L的甘氨酸溶液500 μl，以0.1%冰醋酸定容至刻度，搖勻，以12 000 r/min離心10 min，即得。

2.2.4空白溶液 依“2.2.3”項(xiàng)下方法，以蒸餾水200 μl代替對照品溶液，即得空白溶液。

2.3線性試驗(yàn) 取鹽酸DNJ對照品適量加0.05 mol/L鹽酸制成0.08 mg/ml的對照品溶液，分別精密吸取上述對照品溶液1、2、4、6和8 ml，置10 ml量瓶中，加0.05 mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，按“2.2.3”項(xiàng)下的方法分別制備衍生溶液，進(jìn)樣20 μl，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=-6 786.95+41 822 922.26X(r=0.999 9)。結(jié)果表明，鹽酸1-脫氧野尻霉素對照品濃度在0.008～0.08 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.DNJ

2.4精密度試驗(yàn) 取同一份樣品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μl，結(jié)果平均峰面積為931 154，RSD為1.66%，表明精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品溶液，分別在0、3、6、9和12 h進(jìn)樣，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果平均峰面積為913 392，RSD為1.89%，測定結(jié)果表明，在12 h之內(nèi)色譜峰面積無明顯改變，穩(wěn)定性良好。

2.6重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取同一樣品約1 g，平行稱取6份，按上述方法檢測，每次進(jìn)樣量為20 μl，測定含量，結(jié)果鹽酸DNJ的平均含量為1.13‰，RSD為1.70%。

2.7回收率試驗(yàn) 精密稱取鹽酸DNJ對照品適量置250 ml量瓶中，加0.05 mol/L鹽酸配制成0.03 mg/ml的溶液，搖勻，作為對照品儲備溶液。精密稱取已測定含量的樣品0.75 g，加入對照品儲備溶液25 ml作為第一次提取液，第二次提取按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行，加入0.05 mol/L鹽酸25 ml，合并兩次提取液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成樣品衍生溶液，每次進(jìn)樣量為20 μl。計(jì)算含量和回收率，結(jié)果平均回收率為99.6%，RSD為2.94%，符合要求，見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8各地不同時(shí)間采集樣品(蠶沙、對應(yīng)桑葉)中DNJ含量分析

2.8.1同地區(qū)同時(shí)間桑葉與對應(yīng)蠶沙DNJ含量對比 桑葉中 DNJ含量明顯高于蠶沙，說明蠶在攝食桑葉的過程中對DNJ沒有明顯的富集作用，見表2。

表2 同地區(qū)同時(shí)間桑葉與對應(yīng)蠶沙DNJ含量

2.8.2同時(shí)間不同地區(qū)蠶沙中DNJ含量對比 雖然采集時(shí)間相同，但是蠶沙中DNJ含量與采集地點(diǎn)有很大關(guān)系，其中廣西南寧蠶沙中DNJ含量最高，江蘇次之，四川、河北、陜西等地較低，見表3。

表3 同時(shí)間不同地區(qū)蠶沙中DNJ含量

2.8.3同地區(qū)不同時(shí)間蠶沙中DNJ含量對比 雖然采集地點(diǎn)相同，但是蠶沙中DNJ的含量隨時(shí)間的不同有很大的差異，各地均是秋季蠶沙中DNJ含量明顯高于春季，見表4。

表4 同地區(qū)不同時(shí)間蠶沙中DNJ含量

2.8.4同地區(qū)、同時(shí)間不同品種桑樹喂養(yǎng)得蠶沙中DNJ含量對比 同時(shí)同地采集的蠶沙中，由于喂養(yǎng)的桑葉品種差異而導(dǎo)致的蠶沙中DNJ含量差異性不是很明顯，見表5。

表 5 同地區(qū)同時(shí)間不同品種桑樹喂養(yǎng)得蠶沙中DNJ含量

3 討論

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，蠶沙快速水洗基本不影響DNJ含量(差異約為2%)。但是發(fā)霉變質(zhì)會引起很大的差異，約為60%以上，且DNJ含量越高差異越大，說明中藥材貯藏方法的重要性。

在已有的數(shù)據(jù)中，江蘇省吳江市蠶沙與對應(yīng)桑葉的DNJ含量差異最小。各地采集的樣品(桑葉和蠶沙)中，DNJ含量均是秋季明顯高于春季。

本試驗(yàn)通過對蠶沙中DNJ的提取方法、色譜條件、衍生化反應(yīng)以及方法的準(zhǔn)確度、靈敏度、加樣回收率等環(huán)節(jié)的優(yōu)化，建立了FMOC-Cl柱前熒光衍生-高效液相色譜法測定蠶沙中1-脫氧野尻霉素的方法，該法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可以推廣為桑葉及其相關(guān)產(chǎn)品中DNJ的一般分析方法。

1 蘇海涯，吳躍明，劉建新. 桑葉中的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì).飼料研究，2001，1(9):1

2 趙麗君，齊鳳蘭，瞿曉華，等. 桑葉的營養(yǎng)保健作用及綜合利用.中國食物與營養(yǎng)，2004，1(2):22

3 花俊麗，劉樹興，陳素絹. 超聲波法提取1-脫氧野尻霉素.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，28(6):845

4 劉韋鋆，趙俊，高秀梅，等.1-脫氧野尻霉素提取精致工藝的研究.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27 (10):2079