王彩蓮，殷海濤，劉寶瑞

(1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，南京210009;2南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院)

前列腺癌(PC)多發(fā)生于老年，多數(shù)晚期患者對內(nèi)分泌治療及放化療不敏感。三萜類化合物是近年從中藥連翹中分離的單體化合物，具有抗腫瘤活性。為探討連翹三萜類化合物達(dá)瑪-24-烯-3β-乙酰氧基-20s-醇(DM)對人PC-3細(xì)胞的增殖抑制及放療增敏作用，2009～2010年，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 藥物、試劑與儀器 人PC-3細(xì)胞購自上海細(xì)胞生物所，連翹購自南京市同仁藥房。二甲基亞砜(DMSO，上海凌峰公司)，Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司)，Roche端粒酶檢測試劑盒(上海吉泰生物公司)，流式細(xì)胞儀(美國)，西門子直線加速器(德國)。

1．2 方法

1．2．1 DM分離 連翹粉碎呈粉末狀，8倍量95%乙醇浸泡提取3次，乙醇提取物揮干得浸膏;用水、石油醚、乙酸乙酯分歩萃取法獲得連翹乙酸乙酯提取物，干燥后上硅膠柱，經(jīng)石油醚、乙酸乙酯混合液分次洗脫，收集洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干呈粉末狀;置真空干燥箱40℃過夜、保存。以50 mmol/L的濃度溶于DMSO液中。

1．2．2 細(xì)胞培養(yǎng) PC-3細(xì)胞傳代、培養(yǎng)于含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，加入青霉素、鏈霉素各100 IU/ml，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2．3 細(xì)胞凋亡檢測 取 PC-3傳代細(xì)胞2 ml，以106個/ml密度接種于培養(yǎng)瓶中;細(xì)胞貼壁后，將DM液按終濃度 3．13、6．25、12．5、25．0、50．0 μg/ml分為5組，每組2 ml加入培養(yǎng)瓶中，每個濃度培養(yǎng)5瓶。24、48 h后，分別消化、收集經(jīng)DM作用的細(xì)胞，離心、PBS洗滌各2次，4℃乙醇固定過夜。上機(jī)測定前離心去乙醇，用PBS洗滌1次;過濾后用PBS液懸浮細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，加人RNA酶、PI染色液;30 min后按Annexin V-FITC試劑盒說明書操作，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，觀察細(xì)胞凋亡。

1．2．4 端粒酶活性檢測 將對數(shù)生長期PC-3細(xì)胞接種于6孔板中，每組接種9個復(fù)孔，每孔接種細(xì)胞6×104個。次日分別用含25 μg/ml的DM培養(yǎng)基(DM組)、普通培養(yǎng)基(對照組)替換6孔板的培養(yǎng)液，6、18、48 h后用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法檢測PC-3細(xì)胞端粒酶活性。

1．2．5 細(xì)胞周期相關(guān)基因檢測 將對數(shù)生長期PC-3細(xì)胞接種于6孔板中，每組接種3個復(fù)孔，每孔接種細(xì)胞6×104個。分別用含25 μg/ml的DM培養(yǎng)基(DM組)、普通培養(yǎng)基(對照組)替換6孔板的培養(yǎng)液，18 h后收集細(xì)胞，用 Trizol法提取總RNA;用反轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA，測定cDNA濃度，稀釋為25 ng/μl。Real Time PCR循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性10 s，95℃變性5 s，60℃退火/延伸30 s，共45個循環(huán)。熔融曲線循環(huán)參數(shù)為95℃ 1 min，從55～95℃逐漸升溫，并記錄熒光信號。樣品均設(shè)3個復(fù)孔，以提取的總RNA為陰性對照。引物均為跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)，以免熒光定量PCR過程中可能存在的DNA污染對結(jié)果的干擾。PCR序列略。以β-actin作內(nèi)參，藥物作用前細(xì)胞RNA作對照，參考文獻(xiàn)［1］計(jì)算藥物作用前后的腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)基因 p21、Cyclin D1、CDC25A、TGF-β、Smad3 mRNA表達(dá)。

1．2．6 照射處理及集落形成實(shí)驗(yàn) 用6 mV X線對貼壁后的細(xì)胞進(jìn)行照射，分 0、1、2、3、4、6 Gy 6 個劑量，分單純和聯(lián)合放療。聯(lián)合組在放療同時按25 μg/ml終濃度加DM液2 ml，接種細(xì)胞數(shù)較單純組多，且隨照射劑量增加而增多。48 h后用PBS洗滌除去DM液，培養(yǎng)10～14 d后終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS浸洗2次，純甲醇固定15 min。棄去固定液，加適量Gimsa應(yīng)用液染色20 min;然后流水緩慢洗去染色液，空氣干燥后在顯微鏡下計(jì)數(shù)＞50個細(xì)胞數(shù)的克隆數(shù)，以0 Gy集落形成率作為對照組，計(jì)算各劑量組的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù);用Sigmaplot統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算細(xì)胞存活曲線的D0、N、Dq值。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，組間均數(shù)比較用方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 不同時間、DM濃度誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡率比較 見表1。

表1 不同時間、DM濃度誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡率比較(%，±s)

表1 不同時間、DM濃度誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡率比較(%，±s)

注:與 3．13 μg/ml比較，*P ＜0．05;與 6．25 μg/ml比較，△P ＜0．05

時間DM濃度(μg/ml)3．13 6．25 12．5 25．0 50．0 24 h 8．57 ±0．83 10．05 ±0．42 9．95 ±0．62 10．14 ±0．52 10．27 ±1．33 48 h 14．37 ±2．52 28．07 ±3．06* 45．88 ±4．93＊△ 48．38 ±3．73＊△ 52．34 ±5．50＊△

2．2 DM對PC-3細(xì)胞周期的阻滯作用 DM可引起PC-3細(xì)胞周期重新分布，增加G1期細(xì)胞比例，減少S期細(xì)胞比例，且隨著作用時間延長和濃度增加，這種趨勢更加明顯。

2．3 兩組不同時間PC-3細(xì)胞端粒酶活性比較 見表2。

表2 兩組不同時間PC-3細(xì)胞端粒酶活性比較(±s)

表2 兩組不同時間PC-3細(xì)胞端粒酶活性比較(±s)

組別6 h 18 h 48 h對照組1．37 ±0．02 1．42 ±0．05 1．79 ±0．04 DM 組 1．16 ±0．04 1．17 ±0．03 1．83 ±0．03 P ＜0．05 ＜0．05 ＞0．05

2．4 兩組細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA表達(dá)比較 見表3。

表3 兩組細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA表達(dá)比較(CT，±s)

表3 兩組細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA表達(dá)比較(CT，±s)

組別 p21 Cyclin D1 CDC25A TGF-βSmad3對照組 0．38 ±0．09 0．58 ±0．17 0．72 ±0．18 0．43 ±0．12 0．45 ±0．19 DM 組 0．65 ±0．13 0．36 ±0．11 0．47 ±0．22 0．61 ±0．14 0．62 ±0．25 P ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

2．5 兩組不同放療劑量的PC-3細(xì)胞存活率比較見表 4。單純組 D0 值 3．486、N 值 1．523、Dq 值1．466，聯(lián)合組分別為 2．946、1．318、0．813;兩組放射增敏比(單純組Dq與聯(lián)合組Dq比)為1．80。

表4 兩組不同放療劑量的PC-3細(xì)胞存活率比較(%，±s)

表4 兩組不同放療劑量的PC-3細(xì)胞存活率比較(%，±s)

組別0 Gy 1 Gy 2 Gy 3 Gy 4 Gy 6 Gy單純組 96．48 ±2．17 87．25 ±3．22 76．84 ±2．26 54．48 ±1．99 41．27 ±2．37 29．34 ±1．65聯(lián)合組 94．36 ±3．21 79．59 ±2．34 64．65 ±3．07 43．47 ±4．15 31．39 ±2．63 18．87 ±1．70 P ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 ＜0．05

3 討論

目前，多數(shù)對連翹單體化合物功能的研究在其抗炎、抗病毒方面［2］，部分研究發(fā)現(xiàn)，連翹提取物有較好的抗腫瘤活性［3］。2010年，我們首次從連翹中分離提取了DM，并發(fā)現(xiàn)其與紫杉醇、多西紫杉醇有明顯協(xié)同效應(yīng)［4］。三萜類化合物大部分由30個碳原子組成，可游離或以糖苷的形式存在，與糖結(jié)合的糖苷稱為三萜皂苷。人參、甘草、三七、遠(yuǎn)志等中藥中含有三萜類成分。三萜類化合物主要分為四環(huán)三萜、五環(huán)三萜，四環(huán)三萜的常見抗腫瘤機(jī)制為細(xì)胞毒作用、細(xì)胞周期阻滯、信號通路調(diào)控、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥、促進(jìn)細(xì)胞分化和抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等［5，6］。

本研究發(fā)現(xiàn)，DM 6．25 ～50．0 μg/ml能抑制PC-3細(xì)胞增殖，其隨藥物濃度增加和作用時間延長而增強(qiáng)，有明顯的時效和量效關(guān)系。端粒酶是特殊的反轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)亞單位組成，能以自身RNA模板合成端粒DNA添加到染色體末端，避免染色體復(fù)制丟失端粒DNA使端粒延長，從而延長細(xì)胞壽命。我們發(fā)現(xiàn)DM作用PC-3細(xì)胞6 h后，腫瘤細(xì)胞端粒酶活性降低，48 h后其活性漸恢復(fù)至正常。提示DM有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞周期紊亂及細(xì)胞周期調(diào)控因子分泌失衡是腫瘤細(xì)胞的典型特征。Cyclin D1是周期相關(guān)蛋白基因，其編碼蛋白質(zhì)可促進(jìn)細(xì)胞增殖。p21基因編碼的p21蛋白可抑制細(xì)胞增殖。CDC25A是癌基因，其過度表達(dá)可致細(xì)胞生長失控后惡性轉(zhuǎn)化［7］。TGF-β介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可促進(jìn)靶蛋白泛素化，Smad3是此過程的限速因子。本研究表明，DM可使細(xì)胞周期相關(guān)基因p21、TGF-β、Smad3表達(dá)增加，Cyclin D1、CDC25A表達(dá)降低;提示DM可上調(diào)凋亡基因，抑制抗凋亡基因表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有對腫瘤細(xì)胞多部位、多靶點(diǎn)調(diào)控的特點(diǎn)，可能成為新的抗腫瘤中藥的理想候選藥物之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，DM液25 μg/ml有較高的細(xì)胞凋亡率，故用該濃度作為放療增敏濃度;結(jié)果顯示，聯(lián)合組用25 μg/ml DM液后，其放療增敏作用提高，細(xì)胞存活下降，提示DM液對PC-3細(xì)胞具有放療增敏作用。

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