王菊梅，鄭昭璟，馬擁軍，胡英萍，徐瑞龍，3

（1.衢化醫(yī)院 檢驗科，浙江 衢州 324004；2.金華市中心醫(yī)院 檢驗科，浙江 金華 321000；3.溫州醫(yī)學院 檢驗醫(yī)學院，浙江 溫州 325035）

特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是一種以1型T細胞反應為主的自身免疫性疾病，以外周血血小板（PLT）計數持續(xù)減少為特征。ITP患者體內存在活化的PLT抗原特異性自身反應性T細胞，能識別自體PLT抗原并誘導B細胞產生自身抗體，與PLT結合從而導致網狀內皮細胞系統（reticular-endot-helial system，RES），尤其是脾臟破壞PLT是PLT減少的主要原因[1-3]。

自然殺傷T（natural killer T，NKT）細胞是機體內存在的一類具有免疫調節(jié)功能的T細胞亞群，以表達恒定的T細胞受體（T-cell receptor，TCR）Vα24鏈和Vβ11鏈為特征[4]。NKT細胞數量和功能的變化與多種人類自身免疫性疾病的發(fā)病有關，但相關機制仍未充分闡明[5]。本研究對慢性ITP患者外周血NKT數量進行分析，初步探討其在成人慢性ITP中的意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象 本研究共收集金華市中心醫(yī)院慢性ITP患者68例，選取年齡、性別匹配的同期健康體檢者38例作為對照組（見表1）。慢性ITP的診斷標準參見文獻[6]，即PLT數＜50×109/L并持續(xù)6個月以上；骨髓巨核細胞數量正常或增多，無任何病態(tài)造血形態(tài)學表現；除外任何繼發(fā)的免疫性或非免疫性可以引起PLT減少的其他疾病。所有患者和健康志愿者在標本采集前2周內均未進行激素治療或其他可以影響PLT代謝的藥物。所有慢性ITP患者均處于活動期。臨床上一般將PLT計數小于20×109/L作為預防性PLT輸注以降低臨床出血風險的標準。因此，我們根據患者PLT計數的多少，將慢性ITP患者按照PLT計數分為兩組：即PLT＜20×109/L組（30例）和＞20×109/L組（38例），以研究調節(jié)性T細胞在慢性ITP發(fā)病中可能發(fā)生的作用。

表1 慢性ITP患者與健康對照組一般資料比較

1.2 儀器和試劑 流式細胞儀為Beckman-Coulter Epics XL，流式試劑：CD3-PE-Cy5、Flow-check、IgG1-FITC、IgG2a-PE、Vα24-FITC、Vβ11-PE（Beckman-Coulter，USA)；血細胞分析儀為Sysmex XE-2100及配套試劑；Lympho-Prep密度梯度分離液（Cat#1114545，Axis-Schield，Norway）。

1.3 外周血單個核細胞的分離 慢性ITP組和健康對照組均靜脈穿刺采集EDTA-K2抗凝血6 mL以等量0.9%氯化鈉溶液稀釋后置于6 mL Lympho-Prep密度梯度分離液置水平離心機以離力（RCF）約800 g室溫離心20 min；以毛細滴管吸取介于分離液和血漿層之間的單個核細胞轉移至另外一根試管內，加入等量0.9%氯化鈉溶液300 g室溫繼續(xù)離心10 min，去上清，以pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，重復3次；最后以pH 7.4 PBS重懸細胞并調節(jié)細胞濃度為5×106/mL（PBMNC）待用。

1.4 TCRvα24+vβ11+NKT的檢測 采用三色流式細胞術（FCM）進行NKT細胞的檢測。取兩根12 mm×75 mm流式試管分別標記同型對照和測試管；吸取10μL CD3-PE-Cy5至試管底部，在同型對照管中加入IgG1-FITC（PN IM0639U）和IgG2a-PE（PN A09141）各20μL，在測試管中加入Vα24-FITC（PN IM1589）和Vβ11-PE（PN IM2290）各20μL；每管中均加入100μL的PBMNC，漩渦振蕩混勻后避光、室溫孵育15 min；每管中加入pH 7.4 PBS 2 mL混勻；置水平離心機350 g室溫離心5 min；棄上清，加0.5 mL PBS重懸細胞、待測。見圖1-2。

應用Flow-check進行光路和流路校正以確保儀器正常運行。利用ADC Expo32軟件進行數據獲取和分析。以SSC/FSC結合SSC/CD3設門圈定CD3+細胞分析其中Vα24+Vβ11+占CD3+的百分比即為NKT細胞的水平。每個測試至少檢測100000個CD3+細胞。

1.5 統計學處理方法 采用SPSS 16.0和GraphPad Prism 4.0軟件進行數據的統計分析。兩組比較采用獨立樣本t檢驗；多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊性兩兩比較采用LSD法，方差不齊兩兩比較采用Donnett T3法；非參數檢驗采用Pearson卡方；相關分析采用線性回歸法完成。

圖1 流式細胞術分析成人慢性ITP和健康對照組PBMNCs中的NKT細胞。分別以前向（FSC）/側向（SSC）光散射信號（A）和SSC/CD3（B）設門分析CD3+細胞TCRVα24和TCRVβ11的表達。以同型對照設定CD3+細胞表達TCRVα24和TCRVβ11的閾值（C）。成人慢性ITP患者（D）和健康對照組（E）PBMNCs中NKT細胞的數量以NKT細胞（CD3+Vα24+Vβ11+）占 CD3+的百分比表示并進行比較（F）。

圖2 PLT計數＜20×109/L、＞20×109/L的慢性成人ITP患者及健康對照組外周血NKT細胞數量的比較（A）；慢性成人ITP患者外周血NKT細胞數量與PLT計數的線性回歸分析曲線（實線）和95%可信區(qū)間（點狀線），r=-0.373；P=0.033（B）。

2 結果

2.1 ITP患者和健康對照外周血NKT細胞水平 慢性ITP組PBMNCs中NKT細胞的比例為0.13%±0.03%，高于對照組的0.07%±0.01%，但差異無統計學意義（P>0.05）（見圖1）。但PLT計數＜20×109/L的慢性ITP患者組NKT為0.22%±0.05%，顯著高于健康對照組的0.07%±0.01%（P＜0.05）和PLT計數＞20×109/L的慢性ITP患者組的0.05%±0.01%（P＜0.05），而后兩組間NKT細胞水平的差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 ITP患者外周血NKT細胞與PLT計數的關系 慢性ITP和對照組間NKT細胞的分布差異無統計學意義，但PLT計數＜20×109/L的慢性ITP組中NKT細胞水平顯著高于另外兩組。慢性ITP組外周血NKT細胞水平與血小板計數間的關系的直線回歸分析結果：慢性ITP患者外周血PLT計數與NKT細胞水平間存在負相關，相關系數r=-0.373，P=0.033（見圖 2）。

3 討論

ITP的發(fā)病機制是因機體失去對自身PLT抗原的外周耐受，自體免疫細胞識別自身PLT抗原、產生自身反應性T細胞和自身抗體，從而導致PLT的異常破壞，外周血PLT計數持續(xù)減少。目前認為NKT和Tregs細胞是機體維持外周耐受最為重要的兩種免疫調節(jié)細胞。Johansson等[7]發(fā)現ITP患者外周血NKT細胞的增殖潛力比健康對照組顯著減低、NKT細胞減少，而且這種增殖潛力的降低在激素治療后變得更加顯著，因此推測NKT細胞在ITP發(fā)病機制中發(fā)揮作用?；罨腘KT細胞能通過IL-2依賴機制調節(jié)Tregs細胞的功能，而Tregs細胞能通過細胞接觸依賴機制抑制NKT細胞的增殖、細胞因子分泌和細胞毒活性[8]。Johannson等[9]在1例女性ITP患者中發(fā)現外周血中出現NKT細胞的顯著增高，并且這種增加的NKT細胞能夠抑制自體CD4+細胞的體外增殖活性，推測NKT細胞在ITP患者中具有保護作用。他們的這一觀點得到Ho等[10]結果的支持。Ho等發(fā)現活化的NKT細胞抑制CD8+細胞的體外增殖，并且發(fā)現CD8+NKT細胞通過殺傷抗原提呈細胞的機制限制T細胞的活化。本研究發(fā)現：與對照組比較，ITP患者外周血NKT細胞數量較高但差異無統計學意義。進一步分析得知，ITP患者外周血NKT細胞數量依PLT數量減少程度的不同而有顯著差異，即PLT數量＜20×109/L的慢性ITP患者組NKT細胞數量顯著高于健康對照組和PLT計數＞20×109/L的慢性ITP患者組的NKT數量，而后兩者間的差異仍無統計學意義。本研究還發(fā)現ITP患者外周血NKT細胞與PLT間在數量上存在負相關關系（r=-0.373，P=0.033），這進一步支持NKT細胞在ITP中發(fā)揮作用的觀點。

[1]Cines DB, Blanchette VS. Immune thrombocytopenic purpura[J].N Engl J Med,2002,346(13):995-1008.

[2]Yang R, Han ZC. Pathogenesis and management of chronic idiopathic thrombocytopenic purpura: an update[J].Int J Hematol,2000,71(1):18-24.

[3]Zhou B, Zhao H, Yang RC, et al. Multi-dysfunctional pathophysiology in ITP[J]. Crit Rev Oncol Hematol,2005,54(2):107-116.

[4]Kronenberg M, Gapin L. The unconventional lifestyle of NKT cells[J]. Nat Rev Immunol,2002,2(8):557-568

[5]Wilson BS, Delovitch TL. Janus-like role of regulatory iNKT cells in autoimmune disease and tumour immunity[J]. Nat Rev Immunol,2003,3(3):211-222.

[6]Zhang L, Li H, Zhao H, et al. Hepatitis C virus-related adult chronic idiopathic thrombocytopenic purpura:experience from a single Chinese center[J]. Eur J Haematol,2003,70(3):196-197.

[7]Johansson U, Macey MG, Kenny D, et al.a-Galactosylceramide-driven expansion of human natural killer T cells is inhibited by prednisolone treatment[J]. Br J Haematol, 2004,125(3):400-404

[8]Cava AL, Kaer LV, Shi FD. CD4+CD25+Tregs and NKT cells:regulators regulating regulators[J]. Trends Immunol,2006,27(7):322-327.

[9]Johansson U, Macey MG, Kenny D,et al. The role of natural killer T (NKT) cells in immune thrombocytopenia: is strong in vitro NKT cell activity related to the development of remission?[J]. Br J Haematol,2005,129(3):561-565.

[10]Ho LP, Urban BC, Jones L, et al. CD4-CD8alphaalpha subset of CD1d-restricted NKT cells controls T cell expansion[J]. J Immunol,2004,172(12):7350-7358.

[11]Jimenez MM, Guedon MJA , Martin LM, et al. Measurement of reticulated platelets by simple flow cytometry:An indirect thrombocytopoietic marker[J]. Eur J Intern Med, 2006,17(8):541-544.