張 旭，胡 艷，蔣桂韜，王向榮，李昊幫，戴求仲

（湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)沙 410131）

雞蛋是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食品，是居民主要消費(fèi)的畜產(chǎn)品之一。雞蛋中膽固醇的含量較高，約為213mg·個(gè)-1，為滿足不同人群的需要，低膽固醇雞蛋等具有一定保健功能的雞蛋受到人們關(guān)注，因而有必要對(duì)雞蛋的膽固醇含量進(jìn)行分析[1-5]。另外，目前市場(chǎng)上雞蛋品種繁多，生產(chǎn)者或研究者需要對(duì)雞蛋的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，從而評(píng)定其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，這些都需要有準(zhǔn)確的分析雞蛋膽固醇含量的方法。膽固醇主要存在于蛋黃中，因此，測(cè)定雞蛋中膽固醇含量多以蛋黃為樣本進(jìn)行測(cè)定。膽固醇含量的分析方法有酶法、比色法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，試劑盒法是基于酶法測(cè)定膽固醇的原理進(jìn)行的，比色法一種依據(jù)顯色反應(yīng)來(lái)分析的傳統(tǒng)方法，色譜法是適用范圍較廣、靈敏度較高的分析方法，而高效液相色譜不需要載氣，在使用上較氣相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法簡(jiǎn)便[6-11]。本試驗(yàn)對(duì)液相色譜法、皂化-比色法和試劑盒法測(cè)定蛋黃膽固醇的過(guò)程和結(jié)果進(jìn)行研究和比較，為雞蛋膽固醇含量測(cè)定工作提供方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蛋黃由市售新鮮雞蛋中取出；膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.7%（由中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供）；總膽固醇試劑盒（酶法）由北京北化康泰臨床試劑有限公司提供；顯色液為FeSO4-冰乙酸-濃硫酸，將Fe?SO4100mg溶于1mL蒸餾水中，再加入100 mL冰乙酸混合溶解，然后與100 mL濃硫酸緩慢混勻，冷卻后使用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC法

取新鮮蛋黃稀釋液（濃度為0.1 g·mL-1）1.0 mL于10 mL離心管中，加入95%乙醇1.0 mL，用漩渦振蕩器混勻后，加入乙醚2.5 mL，再次混勻后加入石油醚2.5 mL，震蕩混勻，3000 rpm離心5 min，移出上層萃取液，在低于45℃下用氮?dú)獯蹈?，加無(wú)水乙醇溶解殘余物2.0 mL，用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。色譜條件為色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm；流動(dòng)相：乙腈-異丙醇（4∶1，V/V）；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用色譜級(jí)無(wú)水乙醇溶解配成濃度為1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液，取標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成不同濃度（0～1000 μg·mL-1），以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用外標(biāo)法定量分析樣品中膽固醇含量。

1.2.2 皂化-比色法

稱(chēng)取鮮蛋黃100mg于25 mL試管中，加入KOH-甲醇溶液5 mL（200 g·L-1），漩渦震蕩混勻，置于80℃水浴恒溫振蕩器中皂化10 min，取出冷卻至室溫，加入正己烷10 mL，漩渦震蕩混勻，靜置，將上層液體移入10 mL離心管中，3000 rpm離心10 min，取出上清液60℃下用氮?dú)獯蹈?。然后加入冰乙? mL溶解殘余物，再加入顯色液3 mL于60℃水浴15 min，在490 nm下用722分光光度計(jì)進(jìn)行比色分析，同法做空白樣。將膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解配成1mg·mL-1溶液，取不同體積膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品做同樣處理，以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)制作工作曲線。根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算樣品中膽固醇含量。

1.2.3 試劑盒法

樣品前處理方法同1.2.1，根據(jù)試劑盒說(shuō)明將樣品與工作液混合，37℃保溫5 min后，在波長(zhǎng)500 nm處比色測(cè)定吸光度值，并根據(jù)樣品管和校準(zhǔn)管的吸光度值及校準(zhǔn)品濃度計(jì)算膽固醇含量，計(jì)算式見(jiàn)式（1）。

1.2.4 加標(biāo)回收率的測(cè)定

量取0.1 g·mL-1新鮮蛋黃稀釋液0.5 mL或新鮮蛋黃50mg，加入1mg·mL-1的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液750 μL，按照上述3種方法進(jìn)行處理并分析，根據(jù)結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率。計(jì)算公式見(jiàn)式（2）。

其中，a為測(cè)得加標(biāo)樣中膽固醇的量，b為樣品中膽固醇的量，c為加標(biāo)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定蛋黃膽固醇含量

樣品的高效液相色譜圖見(jiàn)附圖。

由附圖可知，膽固醇的保留時(shí)間為14.662 min。

2.2 測(cè)定結(jié)果比較

3種方法測(cè)定結(jié)果見(jiàn)附表。

通過(guò)對(duì)3種方法的比較發(fā)現(xiàn)，HPLC法的測(cè)定結(jié)果低于皂化-比色法，但差異不顯著（P＞0.05），而試劑盒法的測(cè)定結(jié)果較HPLC法高（P＜0.05），這與Nogueira的結(jié)果相一致[12]。

附圖 樣品的液相色譜圖

附表 3種測(cè)膽固醇方法比較%

目前我國(guó)產(chǎn)膽固醇試劑盒均為血清總膽固醇試劑盒，其測(cè)定原理是膽固醇在膽固醇氧化酶的作用下生成膽甾烯酮，再與氨基安替吡啉反應(yīng)生成紅色醌化物，醌化物顏色深淺與膽固醇含量成正比，試劑盒法測(cè)定結(jié)果較高的原因可能是蛋黃中固醇以外的甾醇類(lèi)物質(zhì)也同氨基安替吡啉反應(yīng)生成有色物，使測(cè)定結(jié)果偏高[13]。HPLC法測(cè)定蛋黃膽固醇結(jié)果的偏差最小，方法的重現(xiàn)性和再現(xiàn)性也好于其他兩種方法，因而HPLC法的精密度較高。皂化-比色法的偏差較大，其原因可能是此法采用皂化、顯色等多步操作，增加了由儀器、試劑和操作等方面帶來(lái)的系統(tǒng)誤差，另外，蛋黃中膽固醇以外的物質(zhì)也可能與硫酸反應(yīng)而生成有色物，給測(cè)定結(jié)果帶來(lái)干擾。試劑盒法的精密度最低，這可能與蛋黃樣品中干擾物質(zhì)較多有關(guān)。在樣品中加入膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品分析加標(biāo)回收率的結(jié)果表明，HPLC法的回收率最好，因而準(zhǔn)確度最高，皂化-比色法居中，試劑盒法的準(zhǔn)確度最低。皂化-比色法的加標(biāo)回收率偏低，可能與膽固醇皂化不完全有關(guān)，皂化時(shí)間短，樣品中膽固醇未能被完全皂化，但皂化時(shí)間長(zhǎng)又可能會(huì)使樣品中增加膽固醇以外的皂化產(chǎn)物而干擾測(cè)定結(jié)果。試劑盒法的加標(biāo)回收率偏高，一方面與甾醇干擾有關(guān)，另一方面，本研究采用手工量取試液在722分光光度計(jì)上進(jìn)行分析，而非全自動(dòng)機(jī)器操作，增大了系統(tǒng)誤差。

3 討論

這3種測(cè)定方法中HPLC法以其高效、高速、高靈敏度的特點(diǎn)成為測(cè)定蛋黃膽固醇含量最準(zhǔn)確的方法，皂化-比色法檢測(cè)雖然不需要昂貴的儀器，但顯色液使用濃硫酸配制，使用和分析過(guò)程中有一定危險(xiǎn)，且蛋黃中干擾物質(zhì)多使測(cè)定的結(jié)果偏差較大[14]。在采用皂化-比色法分析時(shí)，為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究用膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品制作工作曲線而非標(biāo)準(zhǔn)曲線，即將膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品做皂化和提取處理，然后加入顯色液，整個(gè)處理過(guò)程與樣品相同。目前我國(guó)產(chǎn)膽固醇試劑盒均為血清總膽固醇試劑盒，用試劑盒測(cè)定血清膽固醇的方法已被廣泛使用，但用血清總膽固醇試劑盒測(cè)定蛋黃膽固醇含量存在結(jié)果偏高，偏差大的問(wèn)題。譚觀岳等在對(duì)鰻魚(yú)的試驗(yàn)中也得到相似的結(jié)論，另有研究者將氣相色譜法測(cè)定的結(jié)果與試劑盒法比較發(fā)現(xiàn)，試劑盒法的測(cè)定結(jié)果也偏高，而色譜法能夠?qū)⒛懝檀己推渌薮加行У姆蛛x，準(zhǔn)確度高[15-16]。

采用HPLC法測(cè)蛋黃膽固醇應(yīng)使用新鮮蛋黃，不宜使用冷凍蛋黃樣品，蛋黃冷凍后會(huì)發(fā)生凝膠化而很難均勻分散在水中；樣品處理后用0.45 μm濾膜過(guò)濾至EP管中，應(yīng)盡量將EP管裝滿，以避免膽固醇與氧氣接觸而發(fā)生氧化；樣品前處理時(shí)萃取液采用氮吹儀吹干，亦可用真空干燥箱低溫烘干；流動(dòng)相要脫氣，測(cè)樣時(shí)保持柱溫恒定，避免保留時(shí)間偏移。

4 結(jié) 論

高效液相色譜法測(cè)定蛋黃膽固醇含量，方法可靠、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性和再現(xiàn)性好。皂化-比色法的準(zhǔn)確性較HPLC法低，較試劑盒法高。用總膽固醇試劑盒測(cè)定蛋黃膽固醇含量的結(jié)果偏高，不建議使用血清總膽固醇試劑盒來(lái)測(cè)定蛋黃的膽固醇含量。

[1]張旭,戴求仲,蔣桂韜,等.生產(chǎn)低膽固醇雞蛋的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控方法[J].飼料博覽,2010（6）:14-16.

[2]李志瓊.α-亞麻酸對(duì)產(chǎn)蛋雞脂質(zhì)代謝及蛋黃膽固醇沉積的影響及其機(jī)理[M].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[3]Chamruspollert M,Sell J L.Transfer of dietary conjugated linoleic acid toegg yolks of chickens[J].Poult Sci,1999,78（8）:1138-1150.

[4]Ankari A A,Najib H,Hozab A A.Yolk and senum cholesteroland production traits,as affected by incorporating a supraoptimala?mount of copper in the diet of the Leghorn hen[J].Br Poult Sci,1998,39:393-397.

[5]侯永剛,陳輝,黃仁錄,等.苜蓿皂甙對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能、屠體指標(biāo)、膽固醇及血清脂質(zhì)的影響[J].中國(guó)畜牧雜志,2009,49（17）:30-33.

[6]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T 5009.128-2003.食品中膽固醇的測(cè)定[S].2003.

[7]葛慶聯(lián),葛慶豐,劉迪,等.禽蛋中膽固醇的酶催化分光光度測(cè)定法研究[J].食品科學(xué),2009,30（2）:208-210.

[8]張蓉真,李瓏,劉樹(shù)滔,等.測(cè)定雞蛋膽固醇的高效液相色譜新方法[J].色譜,1998,16（2）:91-94.

[9]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.NY/T 1032-2006.飼料中膽固醇含量的測(cè)定[S].2006.

[10]盛靈慧,王晶,武利慶,等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定蛋粉中膽固醇含量[J].食品科學(xué),2008,29（12）:632-634.

[11]張佳程,駱承庠,黃赤男,等.直接皂化-比色法測(cè)定食品中膽固醇的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2000,26（3）:35-38.

[12]Nogueira G C,Bragagnolo N.Assessment of methodology for the enzymatic assay of cholesterol in egg noodles[J].Food Chemistry,2002,79（2）:267-270.

[13]Ulberth F,Reich H,Gas H.Chromatographic determination of cholesterol in processed foods[J].Food Chemistry,1992,43（5）:387-391.

[14]Han C K,Lee N H.Yolk cholesterol content in eggs from the ma?jor domestic strains of breeding hen[J].Australasian Journal of American Studies,1992,5（3）:461-464.

[15]譚觀岳,傅紅,楊琳.HPLC和試劑盒兩種測(cè)定鰻魚(yú)膽固醇方法的比較[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2008,29（4）:148-150.

[16]Beyer R S,Jensen L S.Overestimation of the cholesterol content of eggs[J].Journal of Agricultural Food Chemistry,1989,37（4）:917-920.