常靈竹，苗麗娟

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101）

豬血凝性腦脊髓炎是由豬血凝性腦脊髓炎病毒（HEV）引起仔豬的一種急性、高度接觸性傳染病。臨床上以仔豬嘔吐、衰竭或明顯的神經(jīng)癥狀為主要特征[1]。主要侵害3周齡以下的乳豬，病程約10日，被感染仔豬的發(fā)病率和致死率都可達(dá)100%，成年豬呈隱性感染。該病目前尚無(wú)特效療法和有效疫苗，多數(shù)流行地區(qū)處于呼吸道亞臨床感染狀態(tài)。母源抗體可保護(hù)仔豬不受該HEV的侵害。未獲得母源抗體的仔豬，可在初生后注射高免血清建立被動(dòng)免疫[2-7]。診斷和治療用血清所含的抗體主要為IgG，而IgG在疾病診斷治療方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，制備高純度的抗體顯得尤為重要。本試驗(yàn)擬利用家兔制備抗豬血凝性腦脊髓炎的高免血清，并利用高免血清制備和提純IgG。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

家兔購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 細(xì)胞和病毒

HEV和豬腎細(xì)胞（PK-15細(xì)胞）由吉林大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 HEV的培養(yǎng)與純化

采用單層吸附接毒法繁殖HEV，用10%的MEM培養(yǎng)PK-15傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，傾棄營(yíng)養(yǎng)液，加入HEV，37℃吸附1 h，然后加入2%維持液，置于37℃5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)＞80%的病變時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入冰箱中，經(jīng)反復(fù)凍融2～3次后，將細(xì)胞液集合在同一個(gè)固定的容器中，置于-20℃保存?zhèn)溆肹8]。最后將大量收取的病毒液溶化，將病毒液放入到無(wú)菌的離心管中，6000 rpm、4℃離心30 min，取上清，再用20000 rpm、4℃離心3 h，收集病毒沉淀，用TNE溶解，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，保存于-80℃?zhèn)溆?。測(cè)定純化后HEV感染力的滴度，根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算HEV的TCID50[9]。

1.4 兔抗HEV陽(yáng)性血清的制備

豬血凝性腦脊髓炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)純化后，56℃滅活30 min，滅活后的病毒對(duì)家兔進(jìn)行3次免疫，首次加入弗氏完全佐劑，以后兩次加入弗氏不完全佐劑，佐劑與病毒的比例為1∶1。免疫2只家兔，每只500 μL·次-1（103.4TCID50·100 μL-1），每次間隔14 d，用ELISA方法鑒定血清是否為陽(yáng)性[10]。

1.5 抗體的親和層析純化

1.5.1 飽和硫酸銨粗提IgG

在血清中先加入等體積的PBS，攪拌混合均勻，再緩慢滴加相同體積的飽和硫酸銨，邊滴加邊攪拌，完全混勻后，室溫靜置1 h（或4℃過(guò)夜），10000 rpm離心10 min，收集沉淀，用少量的PBS溶解沉淀，然后裝入透析袋內(nèi)，置于20倍體積的PBS（pH 8.0）中，4 ℃ 透析2 d，每天換液2次[11]。收集脫鹽后的抗體溶液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，備用。

1.5.2 蛋白A親和層析純化IgG

首先將蠕動(dòng)泵、收集器、核酸蛋白測(cè)定儀與層析柱相連；用0.1M pH 8.0的磷酸緩沖液平衡柱床；然后加入經(jīng)飽和硫酸銨粗提的IgG，室溫作用15 min，用0.1M pH 8.0磷酸緩沖液充分淋洗至淋洗液OD值＜0.02。用醋酸-醋酸鈉洗脫緩沖液洗脫所結(jié)合的IgG，收集3 mL于離心管中，應(yīng)用LM17型記錄儀記錄檢測(cè)。先用0.1M pH 8.0磷酸緩沖液平衡柱床，再用20%的乙醇平衡柱床。將收集的液體裝入透析袋內(nèi)，置于PBS溶液中，4℃透析過(guò)夜。次日將透析袋取出，10000 rpm離心15 min，收集上清，用ELISA方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，保存?zhèn)溆谩?/p>

分別取血清和純化后的IgG 0.01 mL作為樣品，分別加入2倍SDS上樣緩沖液與樣本1∶1混合，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，凝膠染色-脫色后，根據(jù)血清和純化后的IgG的蛋白含量，判斷其純化效果[12]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 TCID50測(cè)定結(jié)果

根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算HEV的TCID50，結(jié)果純化后HEV的滴度為103.4TCID50100 μL-1。

2.2 兔抗HEV高免血清的效價(jià)

在第3次免疫后第7 d采血，用ELISA方法測(cè)定兔抗HEV血清效價(jià)，效價(jià)測(cè)定結(jié)果為1∶12800，符合試驗(yàn)要求，采血并分離血清。

2.3 IgG的純化結(jié)果和效價(jià)

經(jīng)過(guò)親和層析純化得到的兔抗HEV IgG，根據(jù)電泳結(jié)果可明顯看到兩條帶，一條為IgG的重鏈，另一條為IgG的輕鏈，見(jiàn)附圖。用ELISA方法測(cè)定兔抗HEV IgG的效價(jià)為1∶50000。

3 討論

試驗(yàn)用ELISA方法測(cè)定兔抗HEV血清效價(jià)，測(cè)定結(jié)果表明，所制備的血清效價(jià)較高，可達(dá)1∶12800；根據(jù)SDS-PAGE電泳結(jié)果可明顯看到兩條帶，一條為IgG的重鏈，另一條為IgG的輕鏈，沒(méi)有其他雜帶，說(shuō)明使用親和層析得到較高純度的IgG，經(jīng)ELISA方法測(cè)定兔抗HEV IgG的效價(jià)高達(dá)1∶50000，比未純化前的血清效價(jià)提高390%。IgG主要是由漿細(xì)胞產(chǎn)生的，是哺乳動(dòng)物血清中主要的免疫球蛋白，約占血清免疫球蛋白總量的75%。IgG在血液中含量高，維持時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)構(gòu)成機(jī)體的免疫力起著重要作用；當(dāng)體內(nèi)缺乏IgG時(shí)，常易患化膿性感染，導(dǎo)致病原微生物經(jīng)血流擴(kuò)散。診斷和治療用血清所含的抗體也主要為IgG，因此制備高純度的抗體顯得尤為重要。要提純IgG必須利用化學(xué)方法從血清中除去血清白蛋白，沉淀出血清γ球蛋白，進(jìn)而用透析和過(guò)濾的方法去除血清γ球蛋白中的鹽類物質(zhì)，得到免疫球蛋白，然后利用這些蛋白質(zhì)的分子量和理化性質(zhì)的差異對(duì)IgG進(jìn)行純化。目前，純化抗體的方法很多，有辛酸-硫酸銨法、鹽析法、凝膠色譜法、離子交換法、親和層析等。但由于純化方法不同抗體的效率不同，甚至同一種方法對(duì)于不同抗體的效果也存在差異[13-15]。蛋白A親和層析純化的抗體純度高，且蛋白A具有良好的再生性，耐受低pH，可反復(fù)利用，長(zhǎng)期不用時(shí)用含適量疊氮鈉的中性緩沖液平衡后，置于4℃保存即可[16]。本研究選取硫酸銨-蛋白A親和層析法對(duì)IgG進(jìn)行了純化，得到了高純度和高效價(jià)的IgG。

[1]耿百成,高豐,賀文琦.豬血凝性腦脊髓炎的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2005,32（6）:56-58.

[2]周鐵忠,李曉衛(wèi),李永深,等.遼寧省豬血凝性腦脊髓炎流行病學(xué)調(diào)查與分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,25（18）:13-17.

[3]蘭云剛,趙魁,王改麗,等.靶向S基因siRNA抑制豬血凝性腦脊髓炎病毒在N2a細(xì)胞中復(fù)制[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,31（3）:303-308.

[4]薛華.哺乳仔豬血凝性腦脊髓炎[J].四川畜牧獸醫(yī),2006（1）:51.

[5]周靈芝,王彬,唐志鵬,等.豬血凝性腦脊髓炎的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)及防治[J].畜牧與飼料科學(xué),2011,32（1）:96.

[6]柳松柏,房莉莉.豬血凝性腦脊髓炎的診斷及防制[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn),2010（1）:72.

[7]劉海燕,俞寧,張平.豬血凝性腦脊髓炎的診斷與科學(xué)防制[J].畜牧與飼料科學(xué),2009,30（7-8）:5-7.

[8]常靈竹,賀文琦,陸慧君,等.豬血凝性腦脊髓炎R(shí)T-PCR方法的建立和初步應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,23（9）:15-18.

[9]殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)（第二版）[M].北京:科學(xué)出版社,1997.

[10]陳克研,趙傳博,賀文琦.豬血凝性腦脊髓炎病毒單克隆抗體的制備與鑒定[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2009,22（9）:907-910.

[11]曹軍平,閻桂玲,劉秀梵,等.兩種簡(jiǎn)易高效的單克隆抗體提純方法[J].單克隆抗體通訊,1995,11（2）:52-54.

[12]薩姆布魯克J,拉塞爾D.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第3版）[M].北京:科學(xué)出版社,2002.

[13]沈關(guān)心,周汝鱗.現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)（第二版）[M].武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社,2002.

[14]何昭陽(yáng),胡桂學(xué),王春鳳.動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].長(zhǎng)春:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,2002.

[15]劉智廣,劉利,劉成剛,等.高效凝膠色譜法辦制備級(jí)純化單克隆抗體[J].單克隆抗體通訊,1995,11（1）:52-55.

[16]張東升,潘衛(wèi)東,高曉東.應(yīng)用Protein A2 Sepharose CL2-4B親和層析法純化單克隆抗體[J].河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1999,12（4）:11-12.