宋曉寧 楊琳 劉小軍 溫樹(shù)鵬 羅建民

受體型蛋白酪氨酸磷酸酶-O(PTPRO)是PTP家族的成員之一。PTPRO在鼠、人類(lèi)等脊椎動(dòng)物中是高度保守的。PTPRO作為一個(gè)重要的酪氨酸磷酸酶，是一個(gè)候選的腫瘤抑制基因，具有重要的生理功能，并具有腫瘤抑制因子的大部分特征，在多種腫瘤組織中被高度甲基化，但是對(duì)PTPRO的研究還處在起步階段。本研究將應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)的方法檢測(cè)PTPRO基因在急性、慢性白血病發(fā)病時(shí)、緩解后、復(fù)發(fā)時(shí)及正常人的表達(dá)情況，初步探討其在白血病發(fā)病中的作用，為分子靶向治療及評(píng)價(jià)預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院血液科2008年8月至2009年10月成人急性白血病(AL)患者80例，慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者15例，同期選擇10例健康志愿者作為正常對(duì)照。均根據(jù)臨床特征、血常規(guī)、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)、免疫表型、融合基因、染色體等檢查確診，符合國(guó)內(nèi)白血病診斷、分型標(biāo)準(zhǔn)。其中AL患者，男46例，女34例;年齡2～72歲，中位年齡32.0歲。CML患者，男9例，女6例;年齡20～65歲，中位年齡42.0歲。健康志愿者，男6例，女4例;年齡12～65歲，中位年齡38.1歲。將研究對(duì)象分為初治組52例［急性髓細(xì)胞白血病(AML)36例，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)16例］，完全緩解組(CR組)28例，CML組15例，正常對(duì)照組(NC組)10例。按PTPRO基因表達(dá)水平中位值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.2 方法

1.2.1 治療方案:對(duì)于初治AML患者采用標(biāo)準(zhǔn)DA化療方案(阿糖胞苷、柔紅霉素)誘導(dǎo)緩解。AML患者采用全反式維甲酸(ATRA)或ATRA與三氧化二砷(As2O3)合用或以ATRA為主，聯(lián)合應(yīng)用小劑量DA(阿糖胞苷、柔紅霉素)、HA(阿糖胞苷、高三尖杉酯堿)方案誘導(dǎo)分化治療。對(duì)于ALL患者選用化療方案VDLP(長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素、強(qiáng)的松、左旋門(mén)冬酰氨酶)。對(duì)于CML患者應(yīng)用羥基脲和小劑量化療加干擾素治療。療效判定參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［1］。

1.2.2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNC)的分離:所有AL患者于治療前均采集新鮮骨髓液4 ml以100 U/ml的肝素抗凝(肝素:骨髓液=1∶4)。用淋巴細(xì)胞分離液分離出MNC備用。

1.2.3 cDNA 合成:取 MNC(1×106)細(xì)胞用 Trizol試劑盒(Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，并用分光光度儀測(cè)定RNA濃度。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶抑制劑(RNasin)、dNTP、Random Primer均購(gòu)自美國(guó)Promega 公司。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下:5 × R.T.buffer 5 μl，Dntp 2.5 μl，Rnasin 2 μl，M-MLV 6 μl，Random Primer 1 μl，RNA 5 μg，用 DEPC 水補(bǔ)至 25 μl;反應(yīng)條件為:42℃ 50 min，95℃5 min。

1.2.4 目的基因引物的合成:以GAPDH為內(nèi)參照基因，引物由上海生物工程公司合成。見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.5 Syber Green I熒光定量PCR PCR反應(yīng)液組成:Primer各1 μl，R.T.product 1 μl，2 × Master Mix 10 μl，雙蒸水補(bǔ)足至反應(yīng)終體積20 μl。反應(yīng)條件如下:96℃ 4 min，然后3步反應(yīng):94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)，于每個(gè)循環(huán)的第3步72℃ 30 s收集熒光信號(hào)。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)入結(jié)果分析界面，以GAPDH為內(nèi)參照基因，與對(duì)照組相比，得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值(RQ值)，將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，常規(guī)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、正態(tài)性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組中PTPRO mRNA的表達(dá)水平的比較 初治組低于CR 組(P=0.028)，CR組低于NC 組(P ＜0.01)，AML與ALL表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.158);CML組低于NC組(P=0.000 ＜0.01)和 CR 組(P=0.01)，與初治組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.295)。PTPRO mRNA表達(dá)水平與年齡、性別均無(wú)關(guān)(P ＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 白血病患者及正常對(duì)照PTPRO基因表達(dá)水平

表2 白血病患者及正常對(duì)照PTPRO基因表達(dá)水平

組別PTPRO mRNA P 值A(chǔ)L 初治組(n=52) 0.7712 ±0.3190 0.000*CR 組(n=28) 1.073 ±0.0978 0.028#CML 組(n=15) 0.6315 ±0.3700 0.295#NC 組(n=10) 1.6497 ±0.5318 0.000#

2.2 基因表達(dá)水平高低與AL患者臨床療效的關(guān)系 52例初治AL中無(wú)早期死亡病例，按照標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療后達(dá)CR的患者有36例。PTPRO基因表達(dá)水平中位值為:0.771。根據(jù)中位值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，2組CR率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

PTPRO是PTP家族的成員之一，第一次發(fā)現(xiàn)于1994年，Thomas等［2］以家兔為模型尋找腎小球特異的蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)PTPRO，當(dāng)時(shí)命名為腎小球上皮蛋白1，即GLEPP1。PTPRO是一類(lèi)組織特異性表達(dá)的基因，主要表達(dá)于腎和腦［3］，高敏感的RT-PCR發(fā)現(xiàn)該基因幾乎存在與所有組織。PTPRO可能對(duì)人類(lèi)腫瘤具有潛在的生長(zhǎng)抑制能力，但要肯定它是一個(gè)真正的腫瘤抑制因子還需要更多的實(shí)驗(yàn)資料來(lái)論證。人們發(fā)現(xiàn)PTPRO具有腫瘤抑制因子的大部分特征，在多種腫瘤組織中被高度甲基化。已經(jīng)證明PTPRO在肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、慢性淋巴白血病中發(fā)現(xiàn)被甲基化而沉默［4－7］。PTPRO的表達(dá)水平變化還可能與乳腺癌的早期發(fā)生有相關(guān)性［8］。但是，目前對(duì)PTPRO基因在白血病中的研究處于起步階段。本實(shí)驗(yàn)中PTPRO在AL患者初治組表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，而緩解組患者表達(dá)水平升高。CML組PTPRO表達(dá)水平也明顯低于NC組。提示AL及CML的發(fā)生可能與PTPRO的表達(dá)下降有關(guān)?；熅徑夂驪TPRO基因水平升高仍未達(dá)到正常對(duì)照水平，提示AL的發(fā)病為多種因素、多個(gè)基因共同作用的結(jié)果。研究同時(shí)還進(jìn)行了PTPRO基因表達(dá)水平高低與臨床療效的關(guān)系的比較。對(duì)52例初治AL患者根據(jù)中位值分為PTPRO高表達(dá)組與PTPRO低表達(dá)組，比較2組的首療程緩解率，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但這有待擴(kuò)大樣本例數(shù)進(jìn)一步研究證實(shí)?？傊?，在AL的發(fā)病中存在PTPRO基因表達(dá)異常，為尋找AL發(fā)生、發(fā)展的特異性分子標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)、預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

表3 PTPRO基因高表達(dá)組與低表達(dá)組緩解率比較 例

1 張之南主編.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn).第3版.北京:科學(xué)出版社.2008.

2 Thomas PE，Wharram BL，Goyal M，et al.GLEPP1，a renal glomerular epithelial cell(podocyte)membrane protein-tyrosine phosphatase.Identification，molecular cloning，and characterization in rabbit.J Biol Chem，1994，269:19953-19962.

3 Kotani T，Murata Y，Ohnishi H，et al.Expression of PTPRO in the interneurons of adult mouse olfactory bulb.J Comp Neurol，2001，518:119-136.

4 Motiwala T，Ghoshal K，Das A，et al.Suppression of the protein tyrosine phosphatase receptor type O gene(PTPRO)by methylation in hepatocellular carcinomas.Oncogene，2003，22:6319-6331.

5 Motiwala T，Kutay H，Ghoshal K，et al.Protein tyrosine phosphatase receptor-type O(PTPRO)exhibits characteristics of a candidate tumor suppressor in human lung cancer.Proc Natl Acad Sci，2004，13844-13849.

6 Mori Y，Yin J，Sato F，et al.Identification of genes uniquely involved in frequent microsatellite instability colon carcinogenesis by expression profiling combined with epigenetic scanning.Cancer Res，2004，64:2434-2438.

7 Motiwala T，Majumder S，Kutay H，et al.Methylation and silencing of protein tyrosine phosphatase receptor type O in chronic lymphocytic leukemia.Clin Cancer Res，2007，13:3174-3181.

8 Ramaswamy B，Majumder S，Roy S，et al.Estrogen-mediated suppression of the gene encoding protein tyrosine phosphatase PTPRO in human breast cancer:mechanism and role in tamoxifen sensitivity.Mol Endocrinol，2009，23:176-187.