張 巖，高世勇，季宇彬

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076;2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076)

酵母β－1，3－葡聚糖是一種抗細(xì)菌、抗真菌、增強免疫活力、毒副作用低、生物活性強的高效生物應(yīng)答物［1］，而且 β－1，3－葡聚糖在醫(yī)學(xué)上還可用于預(yù)防和治療癌癥、免疫缺陷等疾病［2］.多糖發(fā)揮生物活性的首要條件是將多糖溶于水中，但酵母β－1，3－葡聚糖水溶性又很低;100～200 ku分子量的高分子多糖表現(xiàn)出較強的生物活性，但其水溶性均比較差，而可溶性多糖如能基本保留大分子的生物活性，那么分子質(zhì)量大都大于10 ku［3］.分子質(zhì)量的大小和水溶性的強弱對抗腫瘤活性的表達(dá)都有一定的影響［4］.β－1，3－葡聚糖經(jīng)酶水解后可改善其水溶性，提高其利用率.因為β－1，3－葡聚糖經(jīng)酶水解后多聚糖苷鍵斷裂，葡聚糖降解為還原糖或寡糖，其分子質(zhì)量減小，聚合度降低，從而提高其水溶性［5］.β－葡聚糖酶含外切 β－1，3－葡聚糖酶和內(nèi)切β－1，3－葡聚糖酶，它們都可以將β－1，3－葡聚糖水解，從而使分子質(zhì)量降低.酶的活性又受多種因素的影響，如酶質(zhì)量濃度、底物質(zhì)量濃度、溫度、pH值.為使酶發(fā)揮最大活性，就要先了解β－葡聚糖酶的最佳酶解條件.因此本文從β－1，3－葡聚糖被降解為還原糖的得率大小觀察β－葡聚糖酶的最佳酶解條件.

1 材料與儀器

1.1 藥品

β－1，3－葡聚糖(宜興市德圣化工有限公司);β－葡聚糖酶(由湖州禮來生物技術(shù)有限公司).

1.2 試劑

酒石酸鉀鈉(哈爾濱市化工試劑廠);3，5－二硝基水楊酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);氫氧化鈉(天津市大陸化學(xué)試劑廠);苯酚(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);無水亞硫酸鈉(哈爾濱市化工試劑廠);醋酸鈉(天津市百世化工有限公司);醋酸(天津市耀華化學(xué)試劑有限公司);無水葡萄糖(上?；瘜W(xué)試劑采財供應(yīng)端經(jīng)銷).

1.3 儀器

分析天平(奧豪斯國際貿(mào)易有限公司);S－25 pH計(上海雷磁儀器廠);752型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);W201數(shù)控恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司);DK2電熱恒溫振蕩水槽(上海恒科技有限公司).

1.4 試劑的配置

1.4.1 DNS 溶液的配置

稱取酒石酸鉀鈉182.0 g，溶于500mL的單蒸水中(不斷的攪動并加熱，溫度不超過50℃)，按順序加入 3，5－二硝基水楊酸 6.3 g，262mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液，水浴溶解.再加入苯酚5.0 g和無水亞硫酸鈉5.0 g，充分?jǐn)嚢枞芙?，冷卻后用水定溶至1000mL.儲存于棕色瓶并放置冰箱中，7 d后方可使用.

1.4.2 醋酸－醋酸鈉緩沖溶液

取醋酸鈉54.6mg，加1 mol/L醋酸溶液20mL溶解后，加水定容至500mL，即 pH值為6.0.利用pH計的數(shù)值大小來相應(yīng)的加醋酸鈉或醋酸溶液，達(dá)到所需pH值.

2 實驗方法

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取105℃下恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1000 g溶于100mL蒸餾水，配置成1mg/mL的葡萄糖溶液.準(zhǔn)備20mL試管30支，做3個平行，編號1、2、3、4、5、6、7、8、9、10.分別吸取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，加入試管中，用單蒸水補加到1.0mL.然后加入2mL DNS溶液，震蕩混勻于沸水中煮5min，冷卻后加入9mL蒸餾水稀釋混勻，用空白調(diào)零點，于540 nm處測定吸光度值，記錄OD540，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D540為縱坐標(biāo))［6］.

2.2 酶活力測定

加入0.5mL β－1，3－葡聚糖溶液，50 ℃預(yù)熱10min，加入 0.1mL β－葡聚糖酶溶液，并在空白樣補加滅活的酶0.1mL，補加單蒸水0.4mL，混勻后反應(yīng)10min加入2mL DNS溶液，煮沸5min.在540 nm下測定OD值［6］.(酶活單位定義在上述測定條件下，每分鐘從底物溶液中降解釋放1μmol還原糖所需要的酶量為1個酶活單位，簡稱U).稀釋后的酶液OD540在0.2～0.5之間為宜.

2.3 糖質(zhì)量濃度對酶活性的影響

向各個試管中依次加入 0.2、0.8、1.4、1.6、1.8、2、2.4、3、3.6、4mg/mL 糖溶液 0.5mL，預(yù)熱到50℃，加稀釋后的酶液0.1mL，pH值為中性的緩沖液0.4mL(三個平行組)，50℃水浴10min，用DNS中止反應(yīng)，煮沸5min;做空白對照，取滅活的酶 0.1mL、加單蒸水 0.5mL、緩沖溶液 0.4mL.冷卻后加9mL單蒸水，在540 nm下，測還原性糖質(zhì)量濃度.

2.4 酶質(zhì)量濃度對酶活性的影響

取一定質(zhì)量濃度的糖溶液0.5mL，預(yù)熱到50℃，向各個試管中依次加入 0.5、1、6、10、14、18、20、25、30mg/mL 酶液 0.1mL，pH 值為中性的緩沖液0.4mL(三個平行組)，50℃水浴10min，用DNS中止反應(yīng)，煮沸5min;做空白對照，取糖溶液0.5mL、加單蒸水 0.1mL 和緩沖溶液 0.4mL.冷卻后加9mL單蒸水，在540 nm下，測還原性糖質(zhì)量濃度.

2.5 溫度對酶活性的影響

取稀釋后的酶液0.1mL，預(yù)熱到50℃，加入一定質(zhì)量濃度的糖溶液0.5mL，加pH為中性的緩沖液0.4mL(三個平行組)，分別在 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃下水浴10min，用 DNS 中止反應(yīng)，煮沸5min;做空白對照，取滅活的酶0.1mL、糖溶液0.5mL 和緩沖溶液 0.4mL.冷卻后加9mL單蒸水，在540 nm下，測還原性糖質(zhì)量濃度.

2.6 pH值對酶活性的影響

取稀釋后的酶液0.1mL，預(yù)熱到50℃，加入一定質(zhì)量濃度的糖溶液0.5mL，向各個試管中依次加入 pH 值為 3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5緩沖液0.4mL(三個平行組)，50℃水浴10min，用DNS中止反應(yīng)，煮沸5min;做空白對照，取滅活的酶 0.1mL、糖溶液0.5mL 和單蒸水 0.4mL.冷卻后加9mL單蒸水，在540 nm下，測還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù).

2.7 時間對酶活性的影響

取一定質(zhì)量濃度的酶和糖溶液在固定溫度下反應(yīng) 1、5、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180min(3個平行組)在540 nm下的OD值，測還原性糖質(zhì)量濃度.

3 實驗結(jié)果

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

見表1.

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線表

以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，經(jīng)回歸處理得到線性方程 y=1.2095x+0.005(r=0.9995)線性范圍:0 ～0.9mg/mL.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 底物中糖質(zhì)量濃度對酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響

在β－葡聚糖酶的作用下，β－1，3－葡聚糖糖苷鍵斷裂，降解為寡糖或還原性糖.從圖2中得出，最適底物質(zhì)量濃度范圍為1.4～1.8mg/mL，此時還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高;最適的底物質(zhì)量濃度為1.6mg/mL，此時還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大.最初隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加;增加到一定程度，隨底物質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，曲線又呈下降趨勢.曲線下降主要是因為底物質(zhì)量濃度增大的同時，反應(yīng)體系的黏度也在增大，阻礙了底物與酶的接觸;或者是酶量一定時，底物達(dá)到飽和.

圖2 糖質(zhì)量濃度對酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響

3.3 酶質(zhì)量濃度對酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響

從圖3中得出，最適酶質(zhì)量濃度范圍為6～14mg/mL，此時還原性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈增加趨勢并且逐漸減小;但當(dāng)酶質(zhì)量濃度為10mg/mL時，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加幅度最小，并逐漸趨于平衡.主要因為開始酶質(zhì)量濃度小，底物沒有完全降解，而增加到一定程度時底物經(jīng)酶作用趨于完全降解.

圖3 酶質(zhì)量濃度對酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響

3.4 溫度對酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響

圖4 溫度對酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響

從圖4中得出，最適溫度范圍為45～55℃時，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高;最適的溫度為50℃，此時還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到最大.最初隨溫度增加，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，說明酶活增大;溫度增加到一定溫度，超過酶的活性范圍時，對酶有破壞作用，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，酶活減小.

3.5 pH值對酶解產(chǎn)物還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

從圖5中得出，最適pH范圍為5～6時，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高;最適pH值為5.5時，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大.其下降的趨勢主要由于pH值超過酶活性范圍時，pH改變了酶的空間結(jié)構(gòu)，從而使酶活性降低.

圖5 pH值對酶解產(chǎn)物還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

3.6 β－葡聚糖酶酶解的條件優(yōu)化

為了使反應(yīng)條件達(dá)到最佳，得到最大的還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在以上單因素的基礎(chǔ)上，以底物中糖質(zhì)量濃度、酶質(zhì)量濃度、溫度、pH值為試驗因素，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗，表2為正交試驗結(jié)果及分析，表3為方差分析結(jié)果.

表2 正交試驗結(jié)果及分析

表3 方差分析結(jié)果

從表2、3中可以看出，底物中糖質(zhì)量濃度的各水平間的差異極顯著，酶質(zhì)量濃度和溫度各水平間的差異顯著，而相對來說溫度次之，pH值影響最小.綜合各因素對還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，最優(yōu)組合為A1B3C3D2，即反應(yīng)體系中糖質(zhì)量濃度為1.4mg/mL，酶質(zhì)量濃度為14mg/mL，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)pH值為5.5，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.30%.

3.7 酶解時間對酶解產(chǎn)物還原性糖得率的影響

在糖質(zhì)量濃度為1.4mg/mL，酶質(zhì)量濃度為14mg/mL，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)pH值為5.5的條件下，研究不同水解時間對還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，如圖6所示.反應(yīng)時間對酶活力有一定的影響，反應(yīng)時間為1min時，由于時間太短，底物與酶沒有充分接觸，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小;隨著時間的增加還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加;反應(yīng)時間從10min開始，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨于平衡，隨著時間的延長，還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸趨于平衡.

圖6 酶解時間對還原性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

4 討論

β－葡聚糖酶(β－glucanase)是一類水解酶，包含了所有能分解β－糖苷鍵連接的葡萄糖聚合物的酶系.β－葡聚糖酶主要來源于微生物和植物，但人和動物體內(nèi)缺乏［7］.其不但降低底物的聚合度，而且不改變糖的天然結(jié)構(gòu)，不會影響或降低其生物活性［8］.由于作用方式不同，β－葡聚糖酶可分成外切和內(nèi)切，如外切β－1，3－葡聚糖酶、外切β－1，4－葡聚糖酶、內(nèi)切 β－1，3－葡聚糖酶、內(nèi)切β－1，4－葡聚糖酶［9］.β－葡聚糖酶［10］由于可以降解β－葡聚糖分子中的β－1，4和β－1，3糖苷鍵，使其降解為小分子量片段，失去黏性和親水性，使單胃動物腸道中內(nèi)容物的特性、腸道微生物的作用環(huán)境、消化酶的活性等發(fā)生變化，而利于營養(yǎng)物質(zhì)在動物體內(nèi)的消化和吸收，加快生長性能以及糧食的轉(zhuǎn)化率.目前β－葡聚糖酶在各領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的作用，如飼料、紡織、造紙、食品、日化等［11］.

酶是由細(xì)胞產(chǎn)生的具有催化能力的蛋白質(zhì).酶反應(yīng)的優(yōu)點是不改變其結(jié)構(gòu)，反應(yīng)條件溫和，對生物活性影響小，無毒副作用，應(yīng)用廣泛.其又具有顯著的特點，如高度專一性、較高催化效率以及可調(diào)控的酶活性等［12］.但酶法降解對試驗的條件要求比較高，為了使酶發(fā)揮更大的作用，就要先確定底物質(zhì)量濃度、最適溫度、pH值、酶質(zhì)量濃度、最適時間等條件［13］.

我國有十分豐富的酵母資源，年產(chǎn)萬噸的酵母泥，我國對其沒有很好的重視和利用，而作為廉價飼料或作為廢物丟棄，既造成資源浪費又造成環(huán)境污染［14］.對酵母廢泥充分開發(fā)利用，使其中較豐富的β－1，3－葡聚糖被充分利用，如β－1，3－葡聚糖被降解后產(chǎn)生的寡糖不論從溶解性還是生物活性角度比較均優(yōu)于多糖，利用酶將β－1，3－葡聚糖降解為寡糖，可以開發(fā)出價值較高的寡糖產(chǎn)品［15］，提高 β－1，3－葡聚糖的利用率，而且有極大的經(jīng)濟(jì)效益.

β－葡聚糖酶對β－1，3－葡聚糖的降解作用，酶的活性受多種因素的影響.本文從底物質(zhì)量濃度、酶質(zhì)量濃度、最適溫度以及pH值為單因素對酶解后的產(chǎn)物中還原性糖得率的影響，得出最適條件.在此基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的正交試驗，優(yōu)化酶解條件，以期得到得率最大的還原性葡聚糖.最佳條件確立后，進(jìn)而研究酶解時間.

實驗結(jié)果表明，β－1，3－葡聚糖質(zhì)量濃度為1.4mg/mL，β－葡聚糖酶質(zhì)量濃度為 14mg/mL，反應(yīng)溫度為55℃，反應(yīng)pH值為5.5，反應(yīng)10min，還原性糖得率最大，為95.30%.本文的研究內(nèi)容為提高β－1，3－葡聚糖的利用價值提供了依據(jù).

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