陳 平，殷輝莉

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱 150076)

食用菌有較高的食用價(jià)值，例如香菇中含有各種人體必需的氨基酸.鋅是動(dòng)物體內(nèi)許多酶的組成成分，參與了氨基酸、核酸、脂肪、碳水化合物及微量元素等營(yíng)養(yǎng)元素的代謝［1］.而復(fù)合氨基酸配合鹽具有抵抗干擾，很容易被動(dòng)物體消化吸收.在補(bǔ)充鋅的同時(shí)又補(bǔ)充了動(dòng)物體所需的氨基酸.

本文采用食用菌香菇等為原料經(jīng)酸法提取得復(fù)合氨基酸與乙酸鋅(Zn(CH3OO)2)在適當(dāng)條件下進(jìn)行配合反應(yīng)制備復(fù)合氨基－鋅(II)的配合，并對(duì)其最適反應(yīng)條件及結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步的研究.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復(fù)合氨基酸，自制;蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制;乙酸鋅、鹽酸、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、冰醋酸、乙酸鈉、二硫腙、四氯化碳和百里香酚蘭均為分析純，天津市嘉興化工有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;85－2控溫磁力攪拌器，江蘇金壇醫(yī)療儀器廠;LD4－2A低速離心機(jī)，上海科賀圣華科技有限公司;TU1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公責(zé)任公司;722E分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;RE52－98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;GZX－DH－30×35電熱恒溫箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，Spectrum one紅外分光光度計(jì)，PerkinElmer公司.

1.3 復(fù)合氨基酸的制備

經(jīng)過(guò)研磨的食用菌粉取5 g用5 mol/L鹽酸水解，料液比1∶30加熱回流5 h，水解液趁熱過(guò)濾，濾液經(jīng)調(diào)酸度pH值為1.5后加活性碳，在80℃屬于震蕩30min脫色完全，并使用氨基酸交換樹脂對(duì)提取液中復(fù)合氨基酸進(jìn)行純化，然后將純化液加NaOH調(diào)酸度pH值為3.0，再加入丙酮，產(chǎn)生乳白色沉淀，經(jīng)過(guò)離心烘干，制得混合氨基酸［2］.

1.4 鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線的的繪制

采用GB/T 5009.14—1996食品中鋅的測(cè)定方法中的二硫腙比色法.

鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取0.1000 g鋅，加10mL鹽酸(2 mol/L)，溶解后移入1000mL容量瓶中，加水稀釋至刻度.此溶液每毫升相當(dāng)于100.0μg鋅.

鋅標(biāo)準(zhǔn)使用液:吸取1.0mL鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于100mL容量瓶中，加1mL鹽酸(2 mol/L)，定容.此溶液每毫升相當(dāng)于1.0μg鋅.

吸取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL 鋅標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別置于125mL分液漏斗中，各加鹽酸(0.02 moL/L)至20mL.在各分液漏斗中加10mL乙酸－乙酸鹽緩沖液、1mL硫代硫酸鈉溶液(250 g/L)，搖勻，再各加入10.0mL二硫腙使用液，劇烈振搖3min.靜置分層后，將四氯化碳層濾入1 cm比色杯中，以四氯化碳調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，鋅質(zhì)量比(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.5 配合物的合成工藝

取一定質(zhì)量比的復(fù)合氨基酸和乙酸鋅混合溶于250mL水中，控制溶液溫的反應(yīng)度，調(diào)節(jié)pH值，反應(yīng)一定時(shí)間后［3］，減壓抽濾，洗滌沉淀3次.將所得沉淀干燥，得到微黃色產(chǎn)品.

1.5.1 配合物的最佳合成工藝的確定

在復(fù)合反應(yīng)過(guò)程中，反應(yīng)液pH值、溫度、反應(yīng)時(shí)間，這些因素都會(huì)影響著整個(gè)反應(yīng)的進(jìn)程，因而采用單因素分析的方法，固定其中兩個(gè)變量的值，改變另一個(gè)變量的值，從而分析該變量的變化對(duì)復(fù)合反應(yīng)的影響.最后用正交實(shí)驗(yàn)確定最佳的配合條件［4－5］.采用 GB/T 5009.14—1996 食品中鋅的測(cè)定方法中的二硫腙比色分光光度法分析.據(jù)吸光度的變化趨勢(shì)，確定出最適反應(yīng)條件.取反應(yīng)后離心分離得到的上清液做吸光度測(cè)定，來(lái)確定殘余的鋅離子濃度.

1.5.2 配合率的計(jì)算

準(zhǔn)確移取復(fù)合氨基酸－鋅(II)配合物濃縮液10mL于100mL容量瓶中，定容，搖勻.用EDTA絡(luò)合滴定法測(cè)定微量元素的總量.

另移取復(fù)合氨基酸－鋅(II)配合物濃縮液10mL于100mL燒杯中，繼續(xù)加熱濃縮至近干.加入50mL無(wú)水乙醇，水浴溫?zé)岢浞謹(jǐn)嚢韬螅x心分離，將沉淀用水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容，搖勻.用EDTA絡(luò)合滴定法測(cè)定螯合態(tài)微量元素的質(zhì)量比.

準(zhǔn)確移取25mL試液于250mL錐形瓶中，加入50mL水，滴加2～3滴 PAN指示劑，用0.02 mol/L EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液顏色由紫紅變?yōu)榈S色即為滴定終點(diǎn)［6］.

1.5.3 配合物的配合比的確定

采用等摩爾連續(xù)變化法［7］，配制一系列濃度的金屬鋅離子溶液和復(fù)合氨基酸溶液，使鋅離子和復(fù)合氨基酸的濃度總和為一定值，而連續(xù)改變金屬離子和復(fù)合氨基酸的濃度之比值，測(cè)定各測(cè)試溶液的配合率，以吸光度A－f(復(fù)合氨基酸的物質(zhì)的量與鋅離子的物質(zhì)的量之比)作圖，由圖可確定配合物的配合比.

1.5.4 配合產(chǎn)物的確定

對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行紅外分析，確定其為目標(biāo)產(chǎn)物［8］.

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇中復(fù)合氨基酸的組分

分析如表1.

表1 香菇中非必需氨基酸的質(zhì)量比

表2 香菇必需氨基酸的質(zhì)量比

2.2 鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，鋅質(zhì)量比在0～7μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9974，回歸方程 y=0.0938x+0.0406.

圖1 鋅的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 配合物的最佳合成工藝的確定

2.3.1 反應(yīng)最佳溫度的確定

調(diào)節(jié)溶液pH值為8.0，反應(yīng)40min，改變反應(yīng)的溫度，取反應(yīng)后離心分離得到的上清液做吸光度測(cè)定，結(jié)果如圖2所示.

圖2 溫度對(duì)配合反應(yīng)的影響

結(jié)果表明:當(dāng)溫度小于等于60℃時(shí)，吸光度隨溫度的升高而逐漸減小.說(shuō)明在60℃前配合反應(yīng)不完全，大于60℃時(shí)吸光度幾乎不變，配合反應(yīng)完全.

2.3.2 反應(yīng)最佳時(shí)間的確定

調(diào)節(jié)溶液pH值為8.0，反應(yīng)溫度60℃，改變反應(yīng)的時(shí)間，取反應(yīng)后離心分離得到的上清液做吸光度測(cè)定，結(jié)果如圖3所示.

圖3 時(shí)間對(duì)配合反應(yīng)的影響

結(jié)果表明:當(dāng)時(shí)間小于等于40min時(shí)，吸光度隨溫度的升高而逐漸減小.說(shuō)明在40min前配合反應(yīng)不完全，大于40min時(shí)吸光度變化不大，配合反應(yīng)完全.再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間沒有任何意義.

2.3.3 反應(yīng)最佳pH值的確定

控制反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)的時(shí)間40min，調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值，取反應(yīng)后離心分離得到的上清液做吸光度測(cè)定，結(jié)果如圖4所示.

圖4 pH值對(duì)配合反應(yīng)的影響

結(jié)果表明:pH值隨著混合溶液的堿性增強(qiáng)，吸光度在逐漸的減小.當(dāng)pH值為8.0時(shí)最小，當(dāng)pH值大于8.0時(shí)吸光度上升，有副反應(yīng)發(fā)生.說(shuō)明螯合物部分開始解離.

2.3.4 配合物的最佳合成工藝的確定

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以取反應(yīng)后離心分離得到的上清液測(cè)定的吸光度值為指標(biāo)，以反應(yīng)pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度為考察的因素.采用 L9(34)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化合成最佳條件.對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表3、4、5.

表3 因素與水平

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定以配合反應(yīng)pH值、配合反應(yīng)溫度、配合反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素，選用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示.由表4可知，復(fù)合氨基酸－鋅(II)的最佳合成工藝為:配合反應(yīng)pH值為8.0，配合反應(yīng)時(shí)間40min，配合反應(yīng)溫度為65℃.各種因素對(duì)配合反應(yīng)效果影響的主次順序依次為:反應(yīng)pH值＞反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間.通過(guò)方差分析(表5)可知，反應(yīng)pH值因素對(duì)復(fù)合氨基酸－鋅(II)影響均達(dá)顯著水平(P＜0.05)，反應(yīng)時(shí)間不顯著.

表4 正交試驗(yàn)表

表5 正交試驗(yàn)方差分析表

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳條件，即配合反應(yīng)溫度65℃，反應(yīng)時(shí)間40min，反應(yīng)pH值為8.0，進(jìn)行配合反應(yīng)，測(cè)得取反應(yīng)后離心分離得到的上清液的吸光度值為0.008，比正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的較優(yōu)組0.009小.所以認(rèn)為此正交實(shí)驗(yàn)得出的優(yōu)水平是可靠的.

2.5 配合物配合比的測(cè)定

等摩爾連續(xù)變化法實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.

圖5 復(fù)合氨基酸－鋅(Ⅱ)配合比的確定

2.6 配合產(chǎn)物的確定

用KBr壓片法測(cè)定復(fù)合氨基酸－鋅(Ⅱ)在400 ～4000 cm－1的紅外光譜.譜圖如圖6、7.

復(fù)合氨基酸與鋅離子形成配合物后，它的一些主要吸收峰發(fā)生了明顯位移，證實(shí)二價(jià)鋅離子與復(fù)合氨基酸發(fā)生了配位作用.在復(fù)合氨基酸的紅外光譜圖中3067.23 cm－1的峰為－NH2和－COOH中的－OH合起來(lái)的長(zhǎng)寬峰［8］.復(fù)合氨基酸在2747 cm－1、2659 cm－1、2485 cm－1特征峰是醛類的 CH伸縮峰，說(shuō)明復(fù)合氨基酸中有糖類雜質(zhì)的存在，但是在配合物的IR譜圖中完全消失，說(shuō)明雜質(zhì)沒有參與鋅的配合反應(yīng).復(fù)合氨基酸圖譜中1644.02 cm－1由碳基(－C=O)的伸縮振動(dòng)引起的特征吸峰.當(dāng)復(fù)合氨基酸與鋅配合后，配合物的紅外光譜顯示，氨基的特征吸收峰明顯存在，但移至3411.92 cm－1處.同時(shí)，碳基的特征吸收移至1572.66cm－1處.這是由于復(fù)合氨基酸的氨基和羧基氧參與配位形成配合物的結(jié)果.

2.6 配合率的測(cè)定結(jié)果

配合率(%)=(配合態(tài)微量元素的質(zhì)量比/微量元素的總量)×100=(CV1/CV0)×100=(V1/V0)×100

其中:C為標(biāo)準(zhǔn)EDTA溶液的濃度，mol/L;V1為滴定配合態(tài)微量元素所消耗的EDTA溶液體積，mL.V0為滴定微量元素的總量所消耗的EDTA溶液體積，mL.

復(fù)合氨基酸－鋅(Ⅱ)的配合率測(cè)得結(jié)果為98.93%

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)研究了復(fù)合氨基酸與鋅離子配合的最佳反應(yīng)條件，得到最佳反應(yīng)條件為:pH值為8.0，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間40min.通過(guò)等摩爾連續(xù)變化法并通過(guò)IR對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行了初步的表征，測(cè)得產(chǎn)物配合比為2∶1.配合率可達(dá)98.93%.

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