鄭蘭兵 魏 青 劉小玲 劉小雷*

（1 內(nèi)蒙古自治區(qū)第三醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2 內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；3 內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；4.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

病毒感染是病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）最常見的病因，近年來，發(fā)病率有逐漸增多的趨勢，有多種可病毒引起VMC，其中以柯薩奇B組3型病毒（Coxsackie virus，CVB3）最為常見[1]。許多文獻(xiàn)報(bào)道中藥具有明顯的心肌細(xì)胞保護(hù)和抑制病毒增殖作用，黃芪就是其中最重要的一種?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)黃芪中小分子化合物如黃芪甲苷、黃酮類具有肯定的抗病毒作用外，較大的分子化合物，黃芪多糖（ASP）也具有提高免疫保護(hù)心肌細(xì)胞的生物活性[2]。本文利用已經(jīng)建立的病毒性心肌炎細(xì)胞模型，觀察黃芪多糖對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，并試圖探討其心肌保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物、病毒及細(xì)胞株

黃芪多糖（ASP），從蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch）Bge var. mongholicus（Bge.）Hsiao的干燥根，黃芪多糖ASP（Astragalus Sachalinensis Polysaccaride），由中國科學(xué)院蘭州化學(xué)與物理研究所汪道全教授提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.6%；Wistar新生乳鼠心肌細(xì)胞，購自內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證：SCXK（蒙）2002-0001；VERO細(xì)胞：由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所惠贈(zèng)；CVB3病毒：中國科學(xué)院昆明病毒所提供。

1.1.2 主要試劑

免疫組織化學(xué)試劑盒（中山生物技術(shù)公司，SA102）；凋亡檢測試劑盒（寶賽生物技術(shù)公司，CX101-3）；心肌細(xì)胞anti-α-actin（中山生物技術(shù)公司，3111003）；鹽酸胍（華美生物工程公司，BR136）；CK-MB試劑盒（華美生物工程公司，03104）；LDH試劑盒（華美生物工程公司，031020）。

1.1.3 主要儀器

CO2孵箱：日本三洋株式會(huì)社；酶標(biāo)儀（Model550）：美國Bid-Rad公司；低溫離心機(jī)（RC SC）：美國Sorvall公司；高速冷凍離心機(jī)（Z360K）：德國Hermle公司；微量移液器：德國EPPENDORF公司；生物倒置顯微鏡：日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 在VERO細(xì)胞上抗CVB3病毒實(shí)驗(yàn)[3]

試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[3]。

1.2.2 在原代心肌細(xì)胞上抗CVB3病毒實(shí)驗(yàn)[3]

試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[3]。

1.2.3 病毒繁殖抑制實(shí)驗(yàn)[3]

試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[3]。

1.2.4 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)液心肌酶活性測定

1.2.4.1 LDH的測定

試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.4.2 CK-MB的測定

試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[4]。

2 結(jié) 果

2.1 ASP在VERO細(xì)胞上抗CVB3作用

VERO細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明：ASP在31.3μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL濃度下，能抑制CVB3病毒對VERO細(xì)胞破壞作用，與陰性對照組（病毒）比較，OD值有顯著性差異，并呈效應(yīng)與濃度依賴的關(guān)系（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 ASP抗CVB3病毒作用結(jié)果（VERO細(xì)胞）（±s，n=8）

表1 ASP抗CVB3病毒作用結(jié)果（VERO細(xì)胞）（±s，n=8）

注：與病毒對照比較：aP＜0.05，aaP＜0.01；與細(xì)胞對照比較：bP＜0.05，bbP＜0.01

組別 劑量（μg/mL） OD值細(xì)胞對照組 — 0.9493±0.1321病毒對照組 250TCID50 0.5801±0.1299bb病毒＋鹽酸胍組 31.3 0.6251±0.1567 62.5 0.8130±0.0869a 125.0 0.8275±0.0876a病毒+ASP組 7.8 0.5823±0.2292 15.6 0.6781±0.1424 31.3 0.7758±0.2305a 62.5 0.8058±0.1249a 125.0 0.9848±0.3392aa

2.2 ASP在新生乳鼠心肌細(xì)胞上對CVB3的作用

Wistar新生乳鼠心肌細(xì)胞CVB3感染48h后，心肌細(xì)胞出現(xiàn)萎縮、變形及脫落，感染后72h至第5天心肌細(xì)胞搏動(dòng)減弱甚至停止，CPE增多。從表2數(shù)據(jù)可看出，病毒+ASP組（15.6μg/mL、31.3μg/mL、62.5μg/mL）乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常、搏動(dòng)有力。MTT染色數(shù)據(jù)表明：給藥各濃度組與陰性對照組比較，乳鼠心肌細(xì)胞存活率明顯增高，各ASP組與陰性對照組比較，OD值有顯著性差異（P＜0.01），見表2。

表2 ASP抗CVB3病毒作用結(jié)果（原代心肌細(xì)胞）（±s，n=8）

表2 ASP抗CVB3病毒作用結(jié)果（原代心肌細(xì)胞）（±s，n=8）

注：與病毒對照比較：aP＜0.05，aaP＜0.01；與細(xì)胞對照比較：bP＜0.05，bbP＜0.01

組別 劑量（μg/mL） OD值細(xì)胞對照組 — 0.8028±0.1685病毒對照組 250TCID50 0.4088±0.0847bb病毒+鹽酸胍組 15.6 0.4203±0.0952 31.3 0.5985±0.1117aa 62.5 0.6323±0.1248aa病毒+ASP組 3.9 0.4532±0.0837 7.8 0.4564±0.0799 15.6 0.6409±0.1965aa 31.3 0.6439±0.0827aa 62.5 0.6594±0.2543aa

2.3 病毒繁殖抑制試驗(yàn)影響

根據(jù)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)，ASP給藥組在31.3μg/mL劑量下，已造成病毒繁殖抑制作用，125.0μg/mL濃度時(shí)與鹽酸胍對照組抑制作用一致，且有藥物濃度相關(guān)性。

表3 ASP對病毒繁殖抑制影響（VERO細(xì)胞）

2.4 對Wistar新生乳鼠心肌細(xì)胞LDH測定結(jié)果

從表4數(shù)據(jù)看到：ASP對Wistar新生乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性影響，僅在高劑量下（62.5μg/mL）降低其酶活性（P＜0.05）。

２.5 對乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液CK-MB測定結(jié)果

表4 ASP對原代心肌細(xì)胞上清培養(yǎng)液LDH活性影響（±s，n=8）

表4 ASP對原代心肌細(xì)胞上清培養(yǎng)液LDH活性影響（±s，n=8）

注：與病毒對照比較：aP＜0.05，aaP＜0.01 ；與細(xì)胞對照比較：bP＜0.05，bbP＜0.01

組別 劑量（μg/mL） 酶活力單位細(xì)胞對照組 — 6233.0±1024.0病毒對照組 250TCID50 8346.5±1875.0bb病毒+鹽酸胍組 15.6 6918.8±1028.5 31.3 6633.0±1326.1 62.5 6524.0±1423.5a病毒+ASP組 3.9 8308.8±1399.1 7.8 7730.5±1870.8 15.6 7663.5±1221.7 31.3 7015.0±1547.4 62.5 6595.0±1192.6a

從表5數(shù)據(jù)看到：ASP在31.3、62.5μg/mL濃度下可降低Wistar新生乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液CK-MB酶活性，有藥物濃度相關(guān)性（P＜0.05、P＜0.01）。

表5 ASP對培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞CK-MB活性的影響（加病毒48小時(shí)后）（±s）

表5 ASP對培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞CK-MB活性的影響（加病毒48小時(shí)后）（±s）

注：與病毒對照比較：aP＜0.05，aaP＜0.01；與細(xì)胞對照比較：bP＜0.05，bbP＜0.01

組別 樣本數(shù) 劑量（μg/mL） 酶活力單位細(xì)胞對照組 8 — 68.9±18.5病毒對照組 7 250TCID50 152.4±34.8bb病毒+鹽酸胍組 8 15.6 116.2±31.8 8 62.5 75.1±20.5aa病毒+ASP組 6 3.9 126.0±10.8 8 31.3 113.7±25.91 8 7.8 113.5±23.9 8 15.6 112.5±35.9 8 31.3 99.5±19.1a 8 62.5 78.3±15.7aa

3 討 論

本文使用從蒙古黃芪中分離純化的黃白色粉末狀多糖，經(jīng)測定為a-糖苷鍵連接，相對分子質(zhì)量約35000，水解多糖檢出半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖及葡萄糖等。含有糖醛酸為葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，為水溶性酸性雜多糖。

CVB3病毒接種于VERO細(xì)胞時(shí)，可看到VERO細(xì)胞發(fā)生病變，表現(xiàn)為細(xì)胞萎縮、胞質(zhì)顆?；?、折光度增強(qiáng)、與周邊細(xì)胞原有的緊密接觸漸漸消失，最后細(xì)胞變形破裂而從培養(yǎng)皿上脫落[5]。鑒于VERO細(xì)胞對CVB3病毒敏感這一特點(diǎn)，本文以VERO細(xì)胞為敏感細(xì)胞株，采用MTT染色法，研究了ASP在VERO細(xì)胞上的抗CVB3病毒作用。MTT染色結(jié)果表明：ASP在31.3μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL濃度下，能抑制CVB3病毒對VERO細(xì)胞的損傷，與陰性對照組比較，OD值有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），并呈效應(yīng)與濃度依賴的關(guān)系。其作用可能是通過競爭抑制方式阻止CVB3病毒與VERO細(xì)胞結(jié)合，阻礙病毒的吸附而影響病毒的復(fù)制。

新生乳鼠心肌細(xì)胞在感染CVB3病毒后2～5d可出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，早期可直接損害心肌細(xì)胞，不僅能關(guān)閉細(xì)胞核酸及蛋白質(zhì)的合成，且其蛋白酶A2能裂解心肌細(xì)胞中dystrophin蛋白，打亂心肌細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。后期可引起心肌細(xì)胞Ca2+內(nèi)流增加，胞內(nèi)Ca2+濃度超負(fù)荷從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞變形、脫落、損傷、破裂及誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡[6]。由于心肌細(xì)胞的破裂其胞內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）、磷酸激酸激酶（CKMB）釋放明顯增高。因此本文采用心肌細(xì)胞為敏感細(xì)胞株，觀察給予ASP后CVB3病毒對心肌細(xì)胞形態(tài)（MTT染色）及搏動(dòng)影響，測定培養(yǎng)液中LDH及CK-MB的活性。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看到，病毒+ASP組（15.6μg/mL、31.3μg/mL、62.5μg/mL）乳鼠心肌細(xì)胞與病毒對照組比較，細(xì)胞形態(tài)正常、搏動(dòng)有力，MTT染色數(shù)據(jù)表明：給藥各濃度組與陰性對照組比較，乳鼠心肌細(xì)胞存活率明顯增高，OD值有顯著性差異（P＜0.01）。ASP在高劑量下（62.5μg/mL）降低乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH酶活性（P＜0.05），同樣在31.3μg/mL、62.5μg/mL濃度下可降低CK-MB酶活性，且有藥物濃度相關(guān)性（P＜0.05、P＜0.01）。而病毒繁殖抑制的結(jié)果也表明，ASP可抑制CVB3病毒在VERO細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

本文僅觀察了ASP體外細(xì)胞水平上抗CVB3病毒活性，測定ASP在CVB3病毒的攻擊下對VERO和乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)及對CVB3病毒的抑制。ASP的作用機(jī)制和對VMC臨床治療效果，尚需進(jìn)行整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。

[1] 孫成文,周國贛,江巖,等.黃芪多糖抗氧化損傷作用的研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào),1996,12(2):161.

[2] 單俊杰,王順春,劉滌,等.黃芪多糖的化學(xué)和藥理研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2000,14(3):61-64.

[3] 劉小玲,張勇,劉小雷.苦參系列生物堿體外抗CVB3病毒活性[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,23(11):724-730.

[4] 劉小玲,張勇,劉小雷.廣棗總黃酮體外抗CVB3病毒活性[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(12):1-5.

[5] 劉小雷,張憲武,于東升.病毒性心肌炎細(xì)胞調(diào)亡機(jī)制的探討[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志,2005,6(37):92-97.

[6] 劉曉雷,宿瑞俊,賈秀珍,等.黃芪多糖體外抗病毒性心肌炎試驗(yàn)研究[J].中國分子心臟病學(xué)雜志,2003,9(2):79.