高美霞 吳敏慧 紀(jì)云鵬 蔡 莉 王泰瑞 楊 瑩 梁文飚*

（江蘇省血液中心，江蘇 南京 210042）

紅細(xì)胞懸液由全血制備而來，是目前臨床輸血中使用最多的紅細(xì)胞類血液制劑。本研究探討了全血紅細(xì)胞用于MAP紅懸液制備前，其細(xì)胞外pH和作用時間對紅細(xì)胞膜流動性、膜蛋白和形態(tài)的影響，為探討某些特殊情況的血液（如不足量血）制備紅細(xì)胞懸液的應(yīng)用潛能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

HITACHI KY2000型半自動生化分析儀、JEM-1010透射電鏡、島津RF-540型熒光分光光度計、NanoDrop ND-1000微量紫外可見分光光度計、Bio-Rad電泳儀及Quantity One分析軟件；ACD-B全血保養(yǎng)液為山東威高公司產(chǎn)品，1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（diphenyl-hexatriene，DPH）為Sigma公司產(chǎn)品,標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白由MBI公司生產(chǎn)，游離血紅蛋白測定試劑由南京生物建成公司提供。

1.2 方法

1.2.1 紅細(xì)胞在不同pH值環(huán)境的處理

取常規(guī)的ACD-B全血保養(yǎng)液，通過緩慢滴加0.1mol/L NaOH制備成不同pH值（pH分別為5.0、5.6、6.2、6.8和7.4）的全血保養(yǎng)液。隨機(jī)選擇6名知情同意的相同血型健康獻(xiàn)血者、分別采集5mL肝素抗凝全血；立即將6份同型全血混合以減少個體差異，4℃條件下以等滲PBS（pH7.4）緩沖液，2000g離心10min，洗滌3次，稱重壓積紅細(xì)胞，將洗滌紅細(xì)胞均分6份，1份為對照，5份按紅細(xì)胞和全血保養(yǎng)液的體積比為4∶6的比例，懸浮在不同pH值的ACD-B全血保養(yǎng)液中，分別處理4h、8h和24h后。

1.2.2 紅細(xì)胞膜樣品的制備

低滲溶血法制備紅細(xì)胞膜，實(shí)驗(yàn)組和對照組分別取0.5mL壓積紅細(xì)胞，PBS反復(fù)洗滌3次，用0.01mol/L tris-Hcl溶血破膜；然后以10000r/min離心15min，反復(fù)洗滌3次后的乳白色提取物即為紅細(xì)胞膜樣品，所有操作均在4℃條件下進(jìn)行，ND-1000微量紫外可見分光光度計測定紅細(xì)胞膜蛋白濃度。

1.2.3 紅細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE電泳

測定紅細(xì)胞膜蛋白濃度，取20μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，Quantity One軟件分析紅細(xì)胞膜蛋白的組成。

1.2.4 紅細(xì)胞膜流動性的檢測

采用文獻(xiàn)[1]方法。采用熒光偏振法檢測熒光偏振度并計算出紅細(xì)胞膜的微黏度。用四氫呋喃作溶劑配制2×10-3mol/L的熒光探針DPH儲存液，于棕色瓶中4℃保存。臨用前用等滲PBS稀釋為2×10-6mol/L的工作液，取2mL紅細(xì)胞膜蛋白（蛋白濃度0.03g/L），加入2mL DPH工作液，37℃溫育30min，用熒光分光光度計，測定其熒光偏振度P（激光波長362nm，發(fā)射波長432nm激發(fā)狹縫10nm，發(fā)射狹縫10nm）。利用P與微黏度（η）的定量關(guān)系計算出紅細(xì)胞膜的微黏度。

其中IVV為起偏器與檢偏器光軸均在垂直方向時的熒光強(qiáng)度，IVH為起偏器光軸在垂直方向，檢偏器光軸在水平方向時的熒光強(qiáng)度IVV為二者光軸均在水平方向的熒光強(qiáng)度，IHV為起偏器光軸在水平方向、檢偏器光軸在垂直方向的熒光強(qiáng)度，G為校正因子，G=IHV/IHH。

1.2.5 上清FHb濃度的測定

分別在4h、8h和24h檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組上清中FHb濃度。

1.2.6 紅細(xì)胞膜形態(tài)的觀察

取1mm見方的紅細(xì)胞團(tuán)塊，用2.5%戊二醛和1%鋨酸固定后，經(jīng)脫干、墊入、分割、染色，置于電鏡下觀察、拍片記錄。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS15.0進(jìn)行重復(fù)測量數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同pH值處理后，紅細(xì)胞膜熒光偏振度、微黏度和紅細(xì)胞上清中FHb濃度見圖1～3。

圖1 不同pH值儲存環(huán)境和保存時間對紅細(xì)胞膜熒光偏振度的影響

圖2 不同Ph值儲存環(huán)境及保存時間對紅細(xì)胞膜微黏度的影響

圖3 不同Ph值環(huán)境和儲存時間對游離血紅蛋白的影響

圖4 紅細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE電泳分析

圖5 紅細(xì)胞膜受pH值環(huán)境和儲存時間影響而發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變

圖1中，0h與4h和0h與8h處理組中，除pH=6.8組外，各組的熒光偏振度有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；0h與24h處理組中，各組的熒光偏振度均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；4h與8h處理組中，除pH為5.0和5.6組外各組的熒光偏振度有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；4h與24h處理組均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；8h與24h處理組中除pH為5.0和5.6組外均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2中，0h與4h和0h與8h處理組中，除pH=6.8組外，各組的紅細(xì)胞膜微黏度均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；0h與24h處理組中，各組的紅細(xì)胞膜微黏度有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；4h與8h處理組中，除pH為5.0和5.6組外各組的紅細(xì)胞膜微黏度有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；4h與24h處理組均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；8h與24h處理組中除pH為5.0和5.6組外均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3中，0h與4h、0h與8h、0h與24h、4h與8h、4h與24h和8h與24h處理組中，除pH=6.8組外，各組的游離血紅蛋白有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 紅細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE電泳分析見圖4。

圖4中，C為正常對照組，1和2為分別在pH 5.0保養(yǎng)液中處理8h和4h的實(shí)驗(yàn)組；3和4為分別在pH 6.2保養(yǎng)液中處理8h和4h的實(shí)驗(yàn)組；5和6為分別在pH 6.8保養(yǎng)液中處理8h和4h的實(shí)驗(yàn)組。

2.3 全血紅細(xì)胞胞外pH環(huán)境對細(xì)胞膜形態(tài)學(xué)的影響

顯微鏡下觀察的正常紅細(xì)胞，表面光滑，邊緣整齊。當(dāng)紅細(xì)胞胞外pH＜6.8后，紅細(xì)胞膜形態(tài)發(fā)生改變，大部分表面棘狀突起有伸出，并伴隨有細(xì)胞的聚集，見圖5。

3 討 論

紅細(xì)胞周圍環(huán)境pH值的變化可影響脂雙層的穩(wěn)定性和磷脂在細(xì)胞膜上的分布，可改變細(xì)胞膜的力學(xué)特性、細(xì)胞形態(tài)大小以及細(xì)胞內(nèi)Hb分子的結(jié)構(gòu)與濃度而影響紅細(xì)胞的功能和存活[2-4]。研究證實(shí)，紅細(xì)胞胞外酸堿度與細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、膜的變形能力和流動特性以及血紅蛋白的攜氧能力相互密切關(guān)聯(lián)；Gedde報道[5]紅細(xì)胞在胞外pH值低于6.3時，紅細(xì)胞膜曲率為負(fù)數(shù)，可對胞膜的力學(xué)特性及細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響。DPH被認(rèn)為是一種比較敏感的熒光探針，通過測定反映膜脂區(qū)域微黏度的熒光偏振度，可了解膜脂的流動性。我們利用DPH研究了不同pH值保養(yǎng)液和儲存時間對紅細(xì)胞熒光偏振度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，盡管沒有任何標(biāo)本發(fā)生肉眼可見的溶血，但pH在5.0～5.6范圍內(nèi)，紅細(xì)胞的偏振度和微黏度顯著上升，流動性變??；紅細(xì)胞分別在pH6.2和pH7.4的保養(yǎng)液中，其偏振度和微黏度的變化基本相同；只有在pH6.8的保養(yǎng)液中，紅細(xì)胞才具有與正常對照組相同的偏振度和微黏度以及較好的流動性。

紅細(xì)胞正常形態(tài)的維持依賴于細(xì)胞膜及膜骨架的支持，因此細(xì)胞形態(tài)可以反映細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的變化。當(dāng)紅細(xì)胞經(jīng)不同pH值環(huán)境和儲存時間處理后，部分紅細(xì)胞發(fā)生棘突和形態(tài)改變，聚集程度增加，而膜上的自聚集作用可能導(dǎo)致膜融合和形成非專一性離子通道，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。另外，紅細(xì)胞膜流動性的降低，也可造成細(xì)胞膜的損害甚至溶血。紅細(xì)胞在不同pH值保養(yǎng)液中的儲存時間對其微黏度和流動性的影響是顯著的，通過研究與紅細(xì)胞膜的彈性特性相關(guān)的內(nèi)在性膜蛋白Band3的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)在低于pH 6.8的儲存環(huán)境中，Band3的表達(dá)量隨著環(huán)境pH的降低和儲存時間的延長而顯著減少；而在pH 6.8的保養(yǎng)液中，Band3在4h內(nèi)的表達(dá)量與正常對照組基本相同。Band3為多次跨膜蛋白，具有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，Band3和血型糖蛋白分別通過Band 2.1和Band 4.1與收縮蛋白結(jié)合，使骨架網(wǎng)絡(luò)附著于膜脂雙層上形成膜骨架[6]，低pH環(huán)境和保存時問的延長，導(dǎo)致Band3蛋白數(shù)量減少或被氧化、降解，與其他蛋白或自身交聯(lián)、構(gòu)型改變，骨架蛋白失去與膜內(nèi)表面的連接，紅細(xì)胞膜上的脂蛋白及脂質(zhì)逐漸喪失，使紅細(xì)胞膜的微黏度升高，膜流動性降低，紅細(xì)胞逐漸變形，脆性增加。因此，初步的研究結(jié)果表明，盡早將紅細(xì)胞從異常pH環(huán)境中分離出來，對于保證紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能是非常必要的。

目前國內(nèi)外采供血機(jī)構(gòu)普遍使用ACD（pH 5.03），CPD（pH 5.60）和CPDA（pH 5.60）保養(yǎng)液采集全血，由于不足量血的紅細(xì)胞與保養(yǎng)液的比例失調(diào)，導(dǎo)致紅細(xì)胞的胞外pH值低于正常標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而影響紅細(xì)胞的能量代謝和生理功能。本研究的意義在于為進(jìn)一步探討不足量血紅細(xì)胞的百分比含量以及全血分離時間與紅細(xì)胞懸液質(zhì)量的關(guān)系，為不足量血潛在的綜合利用提供依據(jù)，不僅可進(jìn)一步節(jié)約寶貴的血液資源，也體現(xiàn)了對無償獻(xiàn)血者的尊重，在目前血液供應(yīng)緊張的情況下，不失為一種開源節(jié)流、合理用血的應(yīng)對策略之一。

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