靶向超聲微泡與對比超聲（contrast enhanced ultrasound, CEU）相結(jié)合能夠有效評價腎缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury, IRI）已經(jīng)得到了證實，大多數(shù)研究是以內(nèi)皮細胞上相關炎性分子為靶點[1]。腎IRI是腎移植排斥反應中重要的病理過程，研究方向除內(nèi)皮細胞表面外，還應著重于淋巴細胞，因為腎移植排斥反應是以淋巴細胞活化并大量克隆增殖為特征的，但相關研究尚處于初步階段。腎IRI發(fā)生時，能夠非抗原性激活T淋巴細胞，從而使T淋巴細胞表面表達大量炎性因子受體[2，3]。南方醫(yī)院超聲科以T淋巴細胞表面攜帶抗白細胞介素-2受體α（IL-2Rα）為靶點，通過與對比超聲相結(jié)合對腎進行評價，為研究腎移植后排斥反應提供了相關數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 昆明小鼠10只，體質(zhì)量為25～30g，雄性，南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：scxk（粵）2006-0015；二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC，美國Sigma公司）、聚乙二醇（PEG，德國Applichem公司）、生物化脂質(zhì)（DSPE-PEG2000-biotin，美國Avanti公司）、鏈親和素（Streptavidin，美國Sigma公司）、抗小鼠IL-2Rα單克隆抗體（美國RD公司）、EnVision免疫組織化學顯色系統(tǒng)（丹麥Dako公司）、Sequoia 512超聲心動圖儀（德國Siemens公司）。

1.2 制備超聲微泡 參照文獻[4]，以上述脂質(zhì)材料為原料制備普通脂質(zhì)微泡和生物素化脂質(zhì)微泡。生物素化微泡按一定比例加入鏈親和素后再分別加入抗小鼠IL-2Rα單抗和同型對照抗體，制備出靶向超聲微泡（MBIL-2Rα）和同型對照微泡（MB）。

1.3 體外評價超聲微泡 構(gòu)建出MBIL-2Rα和MB后，以庫爾特計數(shù)儀測定微泡的濃度（%）及平均粒徑（μm）；采用綠色熒光標記的二抗與MBIL-2Rα相結(jié)合，熒光顯微鏡下觀察抗IL-2Rα單抗與微泡連接情況。

1.4 建立腎IRI模型 對所有小鼠采用戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉；將小鼠俯臥位，固定四肢于鼠板上；尾靜脈插留置針用于注射微泡。備皮后在脊柱左側(cè)0.5cm處行2.0cm左右縱形切口，游離左腎；用無損傷動脈夾夾閉腎蒂，造成左腎缺血；50min后釋放動脈夾，逐層縫合切口。

1.5 腎對比超聲檢查 再灌注24h后，對實驗小鼠行對比超聲檢查（CEU），并根據(jù)注射超聲微泡的不同分為靶向超聲微泡組（MBIL-2Rα）和對照超聲微泡組（MB）。實驗小鼠取俯臥位，用支架固定Sequoia512超聲機（德國Siemens公司）的高頻超聲探頭（17L5）于小鼠腎上方，調(diào)整探頭位置獲得良好腎顯像；實驗中探頭位置和儀器參數(shù)保持不變。CEU檢查均采用相干脈沖序列成像技術（coherent pulse sequence, CPS）實時觀察，探頭發(fā)射頻率為7.0MHz，機械指數(shù)為0.2。每只小鼠采用微量進樣器經(jīng)尾靜脈隨機先后注射（間隔30min）MB和MBIL-2Rα的數(shù)量約為1×108個。注入微泡5min后行CEU檢查，獲取第1幀圖像，后繼續(xù)存儲圖像23幀后給予高機械指數(shù)（mechenical index, MI）的連續(xù)超聲發(fā)射2～3s以破壞微泡，繼續(xù)存儲本底圖像2～3幀，全部聲學造影圖像存于CD盤，以備脫機分析。微泡破壞前存儲圖像的平均聲強度（Video Intensity, VI）可代表靶向微泡在組織中的總濃度，包括黏附和循環(huán)微泡。微泡破壞后存儲圖像上的平均VI反應的是在血池中循環(huán)微泡的濃度。前者減去后者得到的是黏附微泡在組織中的濃度。取圖結(jié)束后，應用CEU圖像分析軟件（美國Virginia大學）對圖像進行分析，測量小鼠腎造影VI值，單位為灰階強度（U）；并用彩色編碼技術制作腎顯影的彩色編碼圖像，紅色、橙色和白色依次代表腎顯影的強度由弱到強。

1.6 腎病理學檢查 CEU圖像采集后取出小鼠腎，以4%甲醛固定。常規(guī)脫水，石蠟包埋制片。切片作蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫免疫組織化學EnVision法染色。

1.7 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用二階段交叉設計方差分析，組內(nèi)比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲微泡體外評價 庫爾特計數(shù)儀測得MBIL-2Rα濃度為（0.68±0.32）%×109個/ml，微泡平均粒徑為2.70±0.24μm；MB濃度為（0.71±0.39）%×109個/ml，微泡平均粒徑為2.87±0.24μm。與熒光二抗結(jié)合后的MBIL-2Rα在熒光顯微鏡下可見外殼顯明顯綠色熒光（圖1A）；MBIL-2Rα在普通光學顯微鏡可見微泡大小均一、中心透亮、外殼光滑完整（圖1B）。

2.2 腎CEU彩色編碼 第1幀CEU圖像顯示MBIL-2Rα組在左側(cè)腎可見顯著的超聲顯影增強（圖2A）。而MB組左側(cè)腎僅見輕度的超聲顯影增強，其顯影強度較前者明顯減弱（圖2C）；第1幀CEU圖像顯示MBIL-2Rα及MB在右側(cè)腎均無明顯的超聲顯影（圖2B、D）。

2.3 腎對比超聲VI分析 VI值在MBIL-2Rα組和MB組右側(cè)腎均未見明顯增大，分別為3.8±1.5U和3.7±1.7U，兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而在左側(cè)腎MBIL-2Rα組為21.6±4.8U較MB組9.7±2.9U明顯增大，兩者之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MBIL-2Rα組左側(cè)腎VI值為右側(cè)腎的6.8±3.4倍，P＜0.05，而MB組左側(cè)腎VI值僅為右側(cè)腎的3.1±1.9倍，P＜0.05（圖3）。

圖1 A.MBIL-2Rα在熒光顯微鏡下可見外殼顯明顯綠色熒光；B.MBIL-2Rα在普通光學顯微鏡可見微泡大小均一，中心透亮，外殼光滑完整（×400）。圖2 腎臟對比超聲造影彩色編碼圖。A.MBIL-2Rα組在左腎可見顯著的超聲顯影增強；B. MBIL-2Rα組在右腎無明顯的超聲顯影增強；C.MB組左腎僅見輕度的超聲顯影增強，其顯影強度較前者明顯減弱；D. MB組在右腎無明顯的超聲顯影。圖3 MBIL-2Rα和MB組缺血腎（左腎）和非缺血腎（右腎）VI值比較：（1）與MBIL-2Rα比較，P＜0.05；（2）與MB組比較，P＜0.05

2.4 病理及免疫組織化學結(jié)果 HE 切片顯示右側(cè)非缺血腎組織中腎小管排列整齊，形態(tài)正常，間質(zhì)無充血、水腫（圖4）；左側(cè)缺血再灌注腎組織中可見腎小管上皮細胞腫脹、變性，內(nèi)可見管型和壞死脫落細胞，伴腎間質(zhì)水腫及淋巴細胞增多（圖5）。免疫組織化學檢查顯示右側(cè)非缺血腎組織未見明顯淋巴細胞浸潤，未見明顯IL-2Rα表達（圖6）；左側(cè)缺血再灌注腎組織淋巴細胞增多，淋巴細胞表面可見IL-2Rα表達（棕黃色陽性反應物，箭頭示，圖7）。

圖4 ～7 病理學檢查。圖4 顯示右側(cè)非缺血腎組織中腎小管排列整齊，形態(tài)正常，間質(zhì)無充血、水腫。圖5 左側(cè)缺血再灌注腎組織中可見腎小管上皮細胞腫脹、變性，內(nèi)有管型和壞死脫落細胞，伴腎間質(zhì)水腫及淋巴細胞增多（HE，×400）。圖6 右側(cè)非缺血腎組織未見明顯淋巴細胞浸潤，未見明顯IL-2Rα表達。圖7 左側(cè)缺血再灌注腎組織淋巴細胞增多，淋巴細胞表面可見IL-2Rα表達（棕黃色陽性反應物，箭頭示）（ EnVisoon法，×400 ）

3 討論

腎缺血再灌注損傷（IRI）是腎移植過程中不可避免的損傷過程，也是引起急性腎功能衰竭的重要因素之一。近年，在靶向超聲造影領域，腎IRI的相關炎性反應也成為研究熱點，但通常只是作為一種普通的炎性反應來進行研究，且多數(shù)是以血管內(nèi)皮細胞上的靶分子為靶點進行血管內(nèi)成像[1]。但事實上有學者發(fā)現(xiàn)，免疫因素在腎IRI過程中可能發(fā)揮重要作用。一般來說，T淋巴細胞經(jīng)典的活化途徑是抗原依賴性活化，但是在腎IRI中沒有“外來”抗原的刺激，腎IRI后仍有T淋巴細胞的激活、相應炎性分子及分子受體等的上調(diào)[2，3]。根據(jù)這一理論，本實驗直接構(gòu)建腎IRI模型，模擬腎移植過程中的免疫炎性反應，不僅減少了小動物腎移植模型構(gòu)建的繁瑣過程，同時也降低了抗體等的用量。同時，因為IL-2在移植排斥反應中發(fā)揮著重要作用[5]，而以其受體作為靶點，能夠從側(cè)面反應IL-2表達量的多少，從而對移植排斥反應做出評價。因此，不同以往，南方醫(yī)院超聲科嘗試利用T淋巴細胞表面的IL-2Rα為靶點，對腎IRI的炎性反應進行評價。

腎IRI的對比超聲造影結(jié)果顯示：MBIL-2Rα組左腎產(chǎn)生顯著的“主動性靶向超聲分子顯影”[6]，且顯影強度同右腎及MB組相比顯著增強。研究還顯示，MB組左腎VI值也有一定程度升高，提示在此區(qū)域也有一定程度的微泡滯留。其可能機制是在IRI過程中，脂質(zhì)微泡可通過血清補體介導的調(diào)節(jié)作用與激活的白細胞結(jié)合并黏附于組織的小靜脈內(nèi)皮細胞上；而且激活的單核-巨噬細胞和中性粒細胞可通過表面的巨噬細胞抗原復合體-1（Mac-1）或補體受體的介導對脂質(zhì)微泡產(chǎn)生“非免疫球蛋白依賴的吞噬作用”，從而在行對比超聲顯影檢查時可產(chǎn)生一定程度的“被動性靶向?qū)Ρ瘸曪@影”[7]。

應該提出的是，由于本實驗所選擇的靶點與以往不同，位于淋巴細胞表面，MBIL-2Rα在靶向黏附的過程中所伴隨的是淋巴細胞不斷地滾動甚至向間質(zhì)組織的移行、遷出，因此，我們所應用的MBIL-2Rα的劑量同以往相比有所增高，試圖提高MBIL-2Rα的靶向黏附概率。盡管我們對MBIL-2Rα組被動顯影和主動顯影沒有做進一步的區(qū)分，但同MB組相比，MBIL-2Rα組的顯影強度明顯增強，病理改變明顯，也提示檢測敏感度更強。

總之，本實驗結(jié)果主要提供了一種可能性，即是以淋巴細胞表面分子為靶點進行超聲顯影同樣能夠?qū)崿F(xiàn)，同時也為進一步對腎移植排斥免疫反應進行評價提供了理論基礎。

[1]陳少敏, 楊 莉, 賓建平, 等. 攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡行對比超聲評價腎缺血再灌注損傷的實驗研究. 中國醫(yī)學影像技術, 2008, 24(7): 985-987.

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