李書霖，林誠(chéng)祥，李延，田偉

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.香港施隆寶藥業(yè)行，香港;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)［1］。本研究擬觀察心腦通絡(luò)液預(yù)處理聯(lián)合針刺后處理對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量(250±30)g，購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒;戊巴比妥鈉;肝素鈉注射液;磷酸緩沖液;10%緩沖中性甲醛溶液。

1.3 主要儀器 J0－020型小動(dòng)物呼吸機(jī);Mplso16型導(dǎo)電生理記錄儀;GL－16G臺(tái)式高速離心機(jī);電子分析天平;全自動(dòng)生化分析儀等。

2 方法

2.1 缺血再灌注模型的制備［2］

采用穿線結(jié)扎法結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支30min，造成心肌缺血，松開結(jié)扎導(dǎo)致再灌注120min建立缺血再灌注損傷模型。常規(guī)心電圖監(jiān)測(cè)心肌缺血變化，以結(jié)扎后ST段下降1/3以上者以及ST段抬高(或心電圖QRS波突然增高、增寬或T波高聳)為合格模型。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

正常組:大鼠正常飼養(yǎng)，不作任何手術(shù)處理。

假手術(shù)組:大鼠預(yù)先灌服生理鹽水10ml/kg 7天，開胸后在冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)下穿線，不結(jié)扎。

缺血再灌注組:大鼠預(yù)先灌服生理鹽水10ml/kg 7天，結(jié)扎LAD造成缺血30min，再灌注120min。

心腦通絡(luò)液預(yù)處理組:大鼠預(yù)先灌服心腦通絡(luò)液10ml/kg 7天，然后結(jié)扎LAD造成缺血30min，再灌注120min。

針刺后處理組:結(jié)扎LAD造成缺血30min，再灌注120min，再灌注的同時(shí)采用全能脈沖電療儀，對(duì)大鼠內(nèi)關(guān)穴進(jìn)行電針針刺30min，頻率為1Hz，電壓為2V，強(qiáng)度以肢體輕微抖動(dòng)為度。

心腦通絡(luò)液預(yù)處理組+針刺后處理組:大鼠預(yù)先灌服心腦通絡(luò)液10ml/kg 7天，然后結(jié)扎LAD造成缺血30min，再灌注120min。再灌注的同時(shí)采用全能脈沖電療儀，對(duì)大鼠內(nèi)關(guān)穴進(jìn)行電針針刺30min，頻率為1Hz，電壓為2V，強(qiáng)度以肢體輕微抖動(dòng)為度。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定 取結(jié)扎線以下?lián)p傷心肌組織，沖洗并吸干水分，立即置于10%中性甲醛溶液固定，然后常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片(所用玻片預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理)、常規(guī)脫蠟水化。將切片置入稀釋的含1%蛋白激酶K溶液中消化8min，PBS洗滌2min×3次。雙蒸水洗2min×3次。加標(biāo)記緩沖液，以保持切片濕潤(rùn)。取lml封閉液加SABC 10ul，混勻后加至切片上。37℃，2h。PBS洗片，5min×4次。再用DAB顯色10～20min，雙蒸水洗2min×3次。再用蘇木素復(fù)染，PBS及雙蒸水洗2min×3次。脫水、透明、封片。以PBS代替 TdT反應(yīng)液，余操作相同，為陰性對(duì)照。經(jīng)TUNEL法染色的切片在光學(xué)顯微鏡下，顯微攝像，經(jīng)圖象分析系統(tǒng)檢測(cè)分析。檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)和陰性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，以心肌凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總心肌細(xì)胞數(shù)的百分比作為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

3 結(jié)果

經(jīng)TUNEL法染色后，光鏡觀察:以細(xì)胞核著棕黃色顆粒為陽(yáng)性，無(wú)棕黃色顆粒者為陰性。正常組、假手術(shù)組僅可見(jiàn)少量棕黃色顆粒;缺血再灌注組心肌細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)較其他組為多，心腦通絡(luò)液預(yù)處理組、針刺后處理組、心腦通絡(luò)液預(yù)處理+針刺后處理組與缺血再灌注組比較凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少，AI明顯減小，具有顯著性差異(P＜0.01)，其中心腦通絡(luò)液預(yù)處理+針刺后處理組與心腦通絡(luò)液預(yù)處理組、針刺后處理組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較(±s)

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較(±s)

注:與I/R組比較，★P＜0.01;與心腦通絡(luò)液預(yù)處理組、針刺后處理組比較，▲P＜0.05。

Normal組6 3.3 ±0.6 Sham 組 6 3.9 ±0.5 I/R 組 6 25.9 ±5.4心腦通絡(luò)液預(yù)處理組 6 14.4 ±3.9★針刺后處理組 6 13.6 ±3.4★心腦通絡(luò)液預(yù)處理+針刺后處理組 6 10.8±3.6★▲

4 討論

心細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的特征性改變，細(xì)胞凋亡的發(fā)現(xiàn)對(duì)缺血再灌注損傷的預(yù)后判斷具有重要意義。從而提示我們可以從細(xì)胞凋亡角度對(duì)缺血/再灌注后心功能的恢復(fù)及心肌保護(hù)進(jìn)行研究。大量證據(jù)已表明，在心肌缺血/再灌注損傷中，凋亡是細(xì)胞數(shù)量減少的原因之一［3］。本研究結(jié)果亦證實(shí):缺血再灌注組大鼠心肌組織受損程度嚴(yán)重，TUNEL法檢測(cè)所見(jiàn)凋亡細(xì)胞明顯增多，心腦通絡(luò)液預(yù)處理組、針刺后處理組、心腦通絡(luò)液預(yù)處理+針刺后處理組與缺血再灌注組比較凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少。從而進(jìn)一步證實(shí):心肌缺血再灌注損傷可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;心腦通絡(luò)液預(yù)處理、針刺后處理可明顯抑制缺血再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡，降低缺血再灌注損傷的程度，對(duì)心肌有良好的保護(hù)作用。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡圖

［1］胡錦心.抗栓沖劑治療冠心病心絞痛309例療效觀察［J］.北京中醫(yī)雜志，2006，(6):223.

［2］趙宇輝，孫忠人，魏運(yùn)芳.針灸預(yù)處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌Bcl－2mRNA和BaxmRNA基因表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37(1):16－18.

［3］張卓然，李鴻珠，高君，等.丹參注射液抑制大鼠心肌缺血－再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37(1):14－17.