李洪濤，高曦，王樹人，王波

(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖皮質(zhì)激素在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應用，激素性股骨頭壞死是其嚴重的并發(fā)癥，也是臨床常見病、多發(fā)病，病人絕大多數(shù)為青壯年，且病情頑固。該病的發(fā)病機理目前還不是十分清楚，因此對該病的病理機制和發(fā)病過程的研究意義重大。在早期應用糖皮質(zhì)激素的同時，針對其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)早期干預能減少激素性股骨頭壞死的發(fā)生。糖皮質(zhì)激素主要和糖皮質(zhì)激素受體α(GR－α)結(jié)合，發(fā)揮其生理及藥理功能，糖皮質(zhì)激素受體α的密度及親和力與糖皮質(zhì)激素的作用成正相關(guān)。所以在激素性股骨頭壞死早期檢測在股骨頭局部GR－α mRNA的變化，探討其發(fā)病機制，有助于我們尋找早期進行防治的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用純種健康54只雄性成年日本大耳白兔，體質(zhì)量(3.0±0.2)kg(黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，所有動物單籠喂養(yǎng)，通風，自由飲水進食，普通草料喂養(yǎng))。

1.2 主要儀器及藥品試劑

馬血清(HyClone公司);甲強龍(注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉，Pfizer生產(chǎn));骨蝕靈膠囊(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院制藥廠);引物(上海超世生物科技有限公司合成);TRIzol Reagent(Invitrogen公司);DEPC(Sigma公司);RT－PCR試劑盒(Promega公司);寶生物rTaq酶及配套試劑;ABI 9700型PCR擴增儀;臺式低溫高速離心機(Heraeus instruments，德國);穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀(BIO－RAD，美國);水平電泳槽(BIO－RAD，美國);紫外分光光度計(BIO－RAD，美國)。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組

54只日本大耳白兔適應性喂養(yǎng)2周后，精確稱重，以隨機數(shù)字表法將兔子隨機分為3組。Ⅰ組:空白對照組，12只。Ⅱ組:模型組，Ⅲ組:治療組。Ⅱ、Ⅲ兩組共42只，兩次馬血清注射過程中死亡6只，兩次血清注射后再將注射馬血清的家兔隨機分配至Ⅱ、Ⅲ組中，每組18只，三組動物體重經(jīng)t檢驗差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

Ⅰ組:空白對照組(簡稱空白組)12只;Ⅱ組:糖皮質(zhì)激素組(簡稱模型組)18只;Ⅲ組:骨蝕靈組(簡稱治療組)18只。

1.3.2 動物模型的建立及處理措施

模型組和治療組每只第1次經(jīng)耳緣靜脈注射馬血清10mL/kg，間隔3周。第2次按6mL/kg劑量再注射馬血清1次，間隔2周，然后分別按45mg/kg連續(xù)3天，腹腔注射甲強龍3次，注射激素期間各組家兔均臀肌注射青霉素8萬u/只抗感染?？瞻捉M與模型組和治療組于相同時間點于耳緣靜脈和臀肌注射等量生理鹽水作為對照，激素注射4周、8周后分別處死全部動物。

根據(jù)標準體重動物的公斤體重劑量換算公式［1］，換算人－兔的生藥量。于激素注射結(jié)束后第2天開始，按人與兔體表面積換算出的用藥量開始灌胃給藥?？瞻捉M和模型組應用蒸餾水進行空腹灌胃，20mL/2d。治療組給予骨蝕靈膠囊粉末8.16g/kg，相當于生藥2.04g/kg，用蒸餾水調(diào)成混懸液20mL，空腹灌胃給藥，1次/2日。

2 數(shù)據(jù)收集及統(tǒng)計

采用SPSS 11.5對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，所有資料均用均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，各組數(shù)據(jù)組間比較使用one－way ANOVA方法統(tǒng)計，兩組均數(shù)之間的比較應用t檢驗，多個均數(shù)之間的比較應用S－N－K檢驗。計數(shù)資料應用 χ2檢驗(Chi－square test)，P＜0.05表示差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 引物

3.2 β－actin表達

3.2.1 4周β－actin表達 結(jié)果見圖1。

圖1 4周β－actin表達

3.2.2 8周β－actin表達 結(jié)果見圖2。

圖2 8周β－actin表達

3.3 GR－α mRNA的表達

3.3.1 4周GR－α mRNA的表達 結(jié)果見圖3，表1。

圖3 4周GR－α mRNA表達

3.3.2 8周GR－α mRNA的表達 結(jié)果見圖4，表1。

圖4 8周GR－α mRNA表達

表1 4周、8周GR－α mRNA樣本表達量(±s)

表1 4周、8周GR－α mRNA樣本表達量(±s)

注:與空白組比較，★P＜0.05;與治療組比較，▲P＜0.05。

4 周 0.2061 ±0.0136 0.3626 ±0.0254★ 0.4236 ±0.0212★▲8 周 0.1615 ±0.0737 0.4051 ±0.0259★ 0.4514 ±0.0262★▲

4 討論

糖皮質(zhì)激素具有多種強大的作用，其作用通過糖皮質(zhì)激素受體介導。作為配體依賴性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，GR與糖皮質(zhì)激素結(jié)合后，能轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達，產(chǎn)生各種效應。應用激素后可以造成血液的高凝狀態(tài)，導致在股骨頭局部的低氧環(huán)境。所以GR在激素性股骨頭壞死的病程中具有重要作用，而GR－α又是主要的作用受體，因而通過研究在股骨頭局部特定低氧環(huán)境下糖皮質(zhì)激素和GR－α的相互關(guān)系的變化至關(guān)重要。在微觀局部環(huán)境下，低氧和糖皮質(zhì)激素受體關(guān)系密切，低氧可以造成糖皮質(zhì)激素受體的上調(diào)，并產(chǎn)生一種糖皮質(zhì)激素依賴的傾向。將糖皮質(zhì)激素受體減少后，在低氧中糖皮質(zhì)激素的作用被減弱。將低氧誘導因子－1α過表達，可造成糖皮質(zhì)激素受體的上調(diào)，并增強糖皮質(zhì)激素依賴的活性。由此可見，低氧環(huán)境可引起糖皮質(zhì)激素受體的上調(diào)，從而增加糖皮質(zhì)激素的敏感性，這不僅是一種糖皮質(zhì)激素依賴反應的調(diào)節(jié)，還是一種低氧依賴反應和基因表達的調(diào)節(jié)。在本實驗中應用半定量RT－PCR法檢測不同時間點GR－α mRNA表達，GR－α mRNA的表達隨著時間推移各組表達量逐漸升高，進一步增強了糖皮質(zhì)激素對股骨頭局部的作用。近年來，中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)GR的研究上取得了可喜的成績，中藥和糖皮質(zhì)激素合用能夠發(fā)揮糖皮質(zhì)激素的重要作用，同時能降低GC的不良反應［1］，發(fā)揮中醫(yī)“治未病”的優(yōu)勢，具有重要的研究價值。

［1］康天濟，蔣愛麗.補腎實骨湯治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的實驗研究［J］.中醫(yī)藥學報，2009，37(4):32－35.