謝晶日，梁國英，李明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

近年來，脂肪肝發(fā)病率逐年增高，較5年前增加了50倍，且漸趨低齡化。北京、上海等地健康人群普查發(fā)現(xiàn)，脂肪肝患病率達(dá)10% ～15%。有資料報(bào)道，60%～90%的肥胖患者有肝細(xì)胞脂肪變性。脂肪肝的防治應(yīng)該引起我們足夠的重視。經(jīng)過20余年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)及實(shí)驗(yàn)研究，謝晶日教授經(jīng)驗(yàn)方－保肝消脂顆粒是治療非酒精性脂肪肝的有效藥物，在改善臨床癥狀、降脂、保肝方面療效確切［1］，但其具體降脂保肝的作用機(jī)理尚不十分明確。該研究旨在通過觀察保肝消脂顆粒對非酒精性脂肪肝大鼠肝組織抵抗素、細(xì)胞色素P450表達(dá)的治療作用，探討保肝消脂顆粒治療脂肪肝的機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級健康雄性Wistar大鼠共60只，體質(zhì)量(190±10)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 保肝消脂顆粒(柴胡、黃芪、決明子、龍膽草、何首烏、姜黃、豬苓等組成)由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室提供。并制成含生藥0.212g/ml溶液;辛伐他汀(宜昌長江藥業(yè)有限公司，批號H20056876)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 電子稱、移液器、勻漿機(jī)、酶標(biāo)儀、抵抗素、細(xì)胞色素P450ELISA試劑盒。

1.4 建立動(dòng)物模型［2］參照陸元善等人的造模方法，采用高脂飼料喂養(yǎng)，建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，共喂養(yǎng)8周。

1.5 動(dòng)物分組及處理方法 將60只Wistar大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)方法分組:根據(jù)體重將大鼠標(biāo)號(1～60號)，按照隨機(jī)排列表，將動(dòng)物編號與表中的隨機(jī)數(shù)字對應(yīng)，將60只大鼠分為6組，每組10只，即空白組、模型組、保肝消脂顆粒低劑量組、保肝消脂顆粒中劑量組、保肝消脂顆粒高劑量組、辛伐他汀組?？瞻捉M:采用普通飼料飼養(yǎng)，正常飲水，16周后處死;模型組:前8周高脂飲食造模，后8周普通飼料飼養(yǎng)，正常飲水;保肝消脂顆粒低劑量組:前8周高脂飲食造模、后8周正常飼養(yǎng)的同時(shí)給予0.212g/kg藥物灌胃，每日1次;保肝消脂顆粒中劑量組:前8周高脂飲食造模、后8周正常飼養(yǎng)的同時(shí)給予0.424g/kg藥物灌胃，每日1次;保肝消脂顆粒高劑量組:前8周高脂飲食造模、后8周在正常飼養(yǎng)的同時(shí)給予0.848g/kg藥物灌胃，每日1次;辛伐他汀組:前8周高脂飲食造模，后8周在正常飼養(yǎng)的同時(shí)給予4mg/kg的藥物灌胃(將辛伐他汀分散片溶入蒸餾水中，配成濃度為2mg/ml的溶液)，每日1次。

1.6 標(biāo)本采集與處理 造模、治療結(jié)束后，觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛光澤度，稱體重，脫頸椎法處死大鼠，迅速剖腹，觀察肝臟外型、色澤、質(zhì)地，稱取全肝濕重并記錄，取相同部位肝組織，用勻漿器勻漿，按照試劑盒要求采用ELISA法測定肝組織勻漿抵抗素、細(xì)胞色素P450的含量。

1.7 病理學(xué)檢測 取肝右葉部位相同大小相等兩塊肝組織放入4%甲醛中固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察各大鼠肝臟脂肪病變及炎癥表現(xiàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(±s)表示，計(jì)量資料采取方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織勻漿抵抗素水平變化比較 結(jié)果見表1。

表1 各組對肝勻漿組織抵抗素水平的影響(±s)

表1 各組對肝勻漿組織抵抗素水平的影響(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.05，與辛伐他汀組比較，△P＜0.05。

空白組 10 245.36 ±26.27*模型組 10 1020.87 ±23.21保肝消脂低劑量組 10 832.21 ±22.70＊△保肝消脂中劑量組 10 680.04 ±39.47＊△保肝消脂高劑量組 9 333.35 ±18.19＊△辛伐他汀組 10 391.30 ±60.50*

從表1可以看出，模型組大鼠肝勻漿抵抗素水平顯著上升，與空白組、中藥組、西藥組之間差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。保肝消脂低、中、高劑量組與辛伐他汀組之間差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。保肝消脂低、中、高劑量組之間差異顯著，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組肝組織勻漿細(xì)胞色素P450水平變化 結(jié)果見表2。

表2 各組對肝組織勻漿細(xì)胞色素P450水平的影響(±s)

表2 各組對肝組織勻漿細(xì)胞色素P450水平的影響(±s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，與辛伐他汀組比較，△P ＜0.05。

空白組 10 388.39 ±28.90*模型組 10 965.63 ±27.54保肝消脂低劑量組 10 775.51 ±156.82＊△保肝消脂中劑量組 10 691.00 ±26.03＊△保肝消脂高劑量組 9 473.79 ±20.28*辛伐他汀組 10 516.04 ±17.42*

從表2可以看出，模型組大鼠肝勻漿細(xì)胞色素P450水平顯著上升，與空白組、中藥組、西藥組之間差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。中藥低、中劑量組與辛伐他汀組之間差異明顯有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。保肝消脂高劑量組與辛伐他汀組之間有差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

非酒精性脂肪肝(non－alcoholic fatty liver，NAFL)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。其發(fā)病率在一般人群中為20%，現(xiàn)已成為我國常見的慢性肝病之一。根據(jù)其病理改變可分為單純性脂肪肝、脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化［3］。隨著現(xiàn)代社會(huì)飲食結(jié)構(gòu)的變化，非酒精性脂肪肝的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，已經(jīng)成為臨床常見肝病。因此如何有效防治NAFLD可阻止慢性肝病進(jìn)展并改善患者預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量。至今，NAFLD發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。近年來大量研究證明，胰島素抵抗(IR)和線粒體功能紊亂與NAFLD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，IR是NAFLD發(fā)病的始動(dòng)及中心環(huán)節(jié)，可能貫穿于NAFLD發(fā)病全過程［4－5］。然而胰島素抵抗的分子病理學(xué)機(jī)制是多因素的，抵抗素是其中分子之一，是一種約1215u的多肽，屬于C末端富含半胱氨酸的抵抗素樣分子家族(RELMs)，因其可誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗而被命名。最近研究發(fā)現(xiàn)，無論大鼠或人類在發(fā)生慢性肝損害時(shí)均可導(dǎo)致抵抗素在肝臟顯著表達(dá)［6］。Bertolani［7］報(bào)道在人類正常對照組可見抵抗素在肝臟的表達(dá)，NASH組表達(dá)增強(qiáng)，且表達(dá)量與NASH炎癥活動(dòng)度計(jì)分正相關(guān)。細(xì)胞色素P450(CYP)主要有CYPlA、2E和3A，是由CYP基因超家族編碼形成的一族相對非特異性酶，它是藥物代謝與失活作用以及身體其他外來物質(zhì)代謝的重要的酶。史洪濤等［8］利用免疫組織化學(xué)、Western blot方法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測定測定肝細(xì)胞色素P4501A1表達(dá)變化，結(jié)果顯示肝細(xì)胞色素P4501A1基因及蛋白表達(dá)隨著脂肪肝程度的加重明顯增強(qiáng)，表明了NAFLD大鼠肝細(xì)胞色素P4501A1基因的表達(dá)變化與脂肪肝引起的肝臟損害程度密切相關(guān)，肝細(xì)胞色素P4501A1參與了NAFLD的發(fā)生。研究顯示，細(xì)胞色素P450ⅡE1(CYPⅡE1)是二甲基亞硝胺D－脫甲基酶，主要在肝臟表達(dá)，參與許多內(nèi)源性及外源性化合物的代謝，CYP2E1的水平與脂肪變的程度相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠的抵抗素、細(xì)胞色素P450水平明顯增高，通過保肝消脂顆粒干預(yù)后，大鼠肝指數(shù)降低的同時(shí)，抵抗素、細(xì)胞色素P450水平下降，表明肝臟抵抗素、細(xì)胞色素P450參與了脂肪肝的形成，而藥物尤其是中藥保肝消脂顆?？梢悦黠@下調(diào)抵抗素、細(xì)胞色素P450的表達(dá)。據(jù)此可以推斷，保肝消脂顆粒調(diào)節(jié)脂肪代謝機(jī)制可能是通過影響抵抗素、細(xì)胞色素P450的表達(dá)及敏感性來調(diào)節(jié)人體內(nèi)脂肪的代謝過程，從而治療非酒精性脂肪肝性肝病，達(dá)到既保肝又能降低血脂的作用，這亦可能是該藥物作用的靶點(diǎn)之一。

［1］謝晶日，張?zhí)K，王海強(qiáng)，等.保肝消脂沖劑治療脂肪肝的臨床觀察［J］.中國中醫(yī)藥科技，2008，15(2):140.

［2］謝晶日，楊芳，陳飛，等.保肝消脂顆粒對非酒精性脂肪肝大鼠肝組織瘦素的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(4):31－33.

［3］孫月枝，李紅德.趙文霞教授治療非酒精性脂肪肝的經(jīng)驗(yàn)［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2007，15(5):290－291.

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