徐 虹，王馨儀，曹 楊，宋煥祿

蓮子紅皮蛋白微波輔助鹽提工藝優(yōu)化

徐 虹，王馨儀，曹 楊，宋煥祿

(北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風(fēng)味化學(xué)北京市重點實驗室, 北京 100048)

采用微波輔助鹽提法制備蓮子紅皮蛋白，探討料液比、重復(fù)提取次數(shù)、NaCl濃度、提取溫度、提取時間對蛋白提取率的影響。在單因素試驗分析基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗，確定蓮子紅皮蛋白最佳提取工藝條件為微波功率600W、料液比1:12(g/mL)、提取溫度35℃、0.20mol/L NaCl溶液提取20min并重復(fù)提取1次，在此條件下，蛋白提取率可達(dá)85.52%。以HCl為沉淀劑，在等電點pH4.9時，蛋白沉淀率可達(dá)35.96%。采用該方法提取蓮子紅皮蛋白，蛋白收率為30.75%，蛋白純度為83.67%。由此可見蓮子紅皮粉具有可開發(fā)應(yīng)用的良好前景。

蓮子紅皮；蛋白質(zhì)；微波鹽提

蓮子由于其豐富的營養(yǎng)及特殊的滋補(bǔ)和療效，歷來被認(rèn)為是藥食佳品，廣受我國及東南亞、日本人民青睞。據(jù)測定，每100g干蓮子中含蛋白質(zhì)17.2g、脂肪2.0g、碳水化合物67.2g、粗纖維3.0g、VC 5.0mg、VE 2.71mg、VB10.16mg、VB20.08mg。蓮子中的礦物質(zhì)元素含量也十分豐富，特別是其中的鈣、磷、鉀。另外，蓮子心含有如蓮心堿、異蓮心堿、非結(jié)晶性生物堿、氧化黃心樹寧堿等多種生物堿，還含有黃酮類、金絲桃甙、蕓香甙等生物活性成分[1-3]。近年來，蓮子提取物的抗氧化及抗衰老功能也是研究熱點之一[4-9]。我國是產(chǎn)蓮大國，蓮在我國福建、湖北、湖南、浙江、江蘇等地區(qū)都有廣泛種植，年產(chǎn)銷量上百萬噸。隨著人們生活水平的提高及保健意識的增強(qiáng)，蓮子作為保健食品的用量還在逐年增加。

蓮子的加工一般要經(jīng)過干燥、分級、去殼、除皮去心等工序，正規(guī)的蓮子加工采用手工除皮和機(jī)械磨皮兩種方式。雖然生產(chǎn)工藝并不復(fù)雜，但用這兩種方法生產(chǎn)率都較低，且損耗率高。例如采用機(jī)械磨皮法，每加工100kg紅蓮，就會磨去約15kg紅皮粉，只能得到約85kg白蓮。目前這層紅皮粉尚無有效的利用方式，由于味澀甚至不能作為牲畜飼料，只能大量堆于田間地頭，對環(huán)境造成污染。于是為了降低生產(chǎn)成本，就有非法的蓮子加工作坊用有害的“化學(xué)方法”加工：用工業(yè)氫氧化鈉和雙氧水泡后，僅經(jīng)簡單的清水沖洗之后，便烘烤上市。而有的不法作坊為使蓮子外觀更誘人，甚至在加工過程中加入會對人體肝臟造成較大傷害的熒光增白劑。

到目前為止，關(guān)于蓮子紅皮營養(yǎng)價值的研究還未見有文獻(xiàn)報道。因此，本實驗室對機(jī)械磨皮加工中產(chǎn)生的蓮子紅皮粉進(jìn)行深入研究，擬從中提取有效成分，以提高蓮子的綜合利用價值，借此削弱蓮子加工行業(yè)中的不安全因素。據(jù)報道，蓮子蛋白的氨基酸含量達(dá)到WHO規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，將其加入一些特定人群的飲食可以補(bǔ)充賴氨酸的攝入不足，提高蛋白質(zhì)的生物效用[10-11]。傳統(tǒng)的蛋白提取主要采用堿提酸沉法，該法耗費(fèi)大量堿液，后處理復(fù)雜，且所得蛋白質(zhì)純度不高[12-14]。近年來，微波作為輔助提取方法已應(yīng)用于蛋白質(zhì)的提取[15]。微波提取操作簡單，可大大縮短提取時間。本研究以蓮子磨皮加工中產(chǎn)生的第二道紅皮粉(機(jī)械磨皮加工過程中對蓮子進(jìn)行兩道打磨，二道粉約占紅皮粉總量的三分之一)為原材料，采用微波法協(xié)助NaCl溶液從中提取蛋白質(zhì)，并對其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為蓮子的深加工探索新的領(lǐng)域并提供必要的技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子紅皮粉由浙江杭州三湘蓮業(yè)貿(mào)易有限公司提供，過80目篩后置于潔凈棕色瓶中避光保存。

濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、鹽酸、酒石酸鉀鈉、氯化鈉、乙醇、氫氧化鈉(以上均為分析純)、牛血清蛋白。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；JA50033電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；XH-100A微波催化合成萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；TGL-10C高臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3D數(shù)顯pH計 上海三信儀表廠；Spectrumlab 22pc可見分光光度計 上海棱光科技有限公司；FD-1冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康技術(shù)公司；超低溫冰箱 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 蓮子紅皮蛋白的主要提取工藝流程

微波功率參照文獻(xiàn)[7]采用600W，此功率條件下提取率較高，4000r/min離心25min。

1.3.2 工藝優(yōu)化試驗設(shè)計

通過蓮子紅皮粉提取蛋白的單因素試驗分析，對影響其提取蛋白料液比、提取溫度、NaCl濃度、提取時間4個重要因素進(jìn)行正交試驗。以蛋白提取率為指標(biāo)，采用L9(34)設(shè)計進(jìn)行正交試驗獲取最優(yōu)工藝參數(shù)，以期獲得這些因素對蛋白提取率影響的大致變化趨勢，并考察各因素對提取率影響的主次順序。

1.3.3 蓮子紅皮粉總蛋白含量和提取物蛋白純度測定

總蛋白含量采用微量凱氏定氮法，換算系數(shù)為6.25。

1.3.4 提取液中蛋白質(zhì)含量測定和蛋白提取率的計算

提取液中蛋白質(zhì)含量采用雙縮脲法測定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)試樣。

1.3.5 蓮子紅皮蛋白等電點的測定和蛋白沉淀率的計算

將蓮子紅皮蛋白提取液用0.01mol/L鹽酸調(diào)pH值分別為4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5，使蛋白質(zhì)沉淀，離心后取上清液進(jìn)行比色測定，吸光度最小的即為等電點。

1.3.6 蓮子紅皮蛋白收率的計算

2 結(jié)果與分析

2.1 蓮子紅皮總蛋白含量測定結(jié)果

本研究測得蓮子紅皮二道粉中總蛋白的含量為17.65%。

2.2 影響蓮子紅皮蛋白提取率的單因素試驗

2.2.1 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響

取不同料液比1:6、1:9、1:12、1:15、1:18(g/mL)分別浸提，在NaCl溶液濃度0.15mol/L、提取溫度35℃、微波600W輻射的條件下提取15min，測定蓮子紅皮蛋白的提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of material/liquid ratio on protein yield

從圖1可知，當(dāng)提取液的料液比在1:6～1:15范圍內(nèi)，蓮子蛋白的提取率隨提取液用量的增大而升高，當(dāng)料液比達(dá)到1:15時提取率最高。當(dāng)提取液用量繼續(xù)增大時，提取率基本趨于穩(wěn)定，略有下降。這可能是因為有機(jī)溶劑萃取是固-液相之間的擴(kuò)散過程，在一定范圍增加鹽液用量能增加固-液接觸面積，提高溶劑擴(kuò)散速率和傳質(zhì)速率?？紤]到食品工業(yè)生產(chǎn)過程中，料液比太大會增加后處理的負(fù)擔(dān)，使產(chǎn)品成本增大，因此選取料液比1:15進(jìn)行提取比較適宜。

2.2.2 NaCl濃度對提取率的影響

分別配制0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mol/L NaCl溶液作為提取液，在料液比1:15、提取溫度35℃、微波600W輻射的條件下提取15min，測定蓮子紅皮蛋白的提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 NaCl濃度對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of NaCl concentration on protein yield

從圖2看出，隨NaCl濃度的加大，蓮子蛋白質(zhì)的提取率逐漸提高。當(dāng)NaCl濃度為0.15mol/L時，其提取率為81.45%，繼續(xù)加大NaCl濃度，其提取率反而急速下降。這可能是由于較低濃度NaCl溶液的鹽溶作用可促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，而NaCl濃度過高，物料中的許多黏性物質(zhì)和鹽膠團(tuán)的形成降低了蛋白質(zhì)溶出，從而影響提取率。所以鹽提蓮子紅皮蛋白最適NaCl濃度為0.15mol/L。

2.2.3 提取時間對提取率的影響

提取時間分別取5、10、15、20、25min，在NaCl濃度0.15mol/L、料液比1:15、提取溫度35℃、微波600W輻射的條件下提取15min，測定蓮子紅皮蛋白的提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on protein yield

由圖3可知，在提取時間5～15min范圍內(nèi)，提取率升高比較明顯，15min后蛋白提取率呈緩慢下降趨勢。這可能由于蓮子粉本身需要一定的溶脹時間。另外，微波萃取法使試樣介質(zhì)內(nèi)各點受到的作用一致，降低蛋白質(zhì)與試樣基體的結(jié)合力，加速蛋白質(zhì)從固相進(jìn)入溶劑的過程，大大縮短了提取時間，避免長時間提取出現(xiàn)的不良因素(如蛋白質(zhì)變性)。因此，確定15min為最佳提取時間。

2.2.4 提取溫度對提取率的影響

設(shè)定提取溫度分別為25、30、35、40、45℃，在NaCl濃度0.15mol/L、料液比1:15、微波600W輻射的條件下提取15min，測定蓮子紅皮蛋白的提取率，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on protein yield

由圖4可看出，在25～35℃范圍內(nèi)，提取率隨著溫度的升高而上升，這可能是因為體系溫度升高，分子運(yùn)動加速，蛋白質(zhì)的滲透、溶解、擴(kuò)散速度也加快，因而蛋白質(zhì)更易于從原料中溶出。當(dāng)溫度到達(dá)35℃時，提取率達(dá)到最高80.49%。之后隨著溫度的升高，提取率明顯降低，故提取溫度取35℃為宜。

2.2.5 重復(fù)提取次數(shù)對蛋白質(zhì)提取率的影響

設(shè)定重復(fù)提取次數(shù)分別為0、1、2次，在NaCl濃度0.15mol/L、料液比1:15、提取溫度35℃、微波600W輻射的條件下提取15min，測定蓮子紅皮蛋白的提取率，結(jié)果見圖5。

圖5 重復(fù)提取次數(shù)對蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of repeat extraction times on protein yield

從圖5可知，當(dāng)進(jìn)行1次重復(fù)提取的時候，蓮子蛋白的提取率比不進(jìn)行重復(fù)提取時的提取率升高約10%，而進(jìn)行2次重復(fù)提取的時候，雖然蛋白質(zhì)提取率比1次重復(fù)提取時稍有升高，但升高的空間僅僅在2%左右。在工業(yè)生產(chǎn)中，增加一次提取就會增大運(yùn)行成本和降低生產(chǎn)效率，綜合成本與收益，將重復(fù)提取次數(shù)定為1次較為適宜。

2.3 微波鹽提蓮子紅皮蛋白工藝的優(yōu)化

2.3.1 正交優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，對影響蓮子紅皮蛋白提取率的料液比、NaCl濃度、提取時間和提取溫度進(jìn)行L9(34)正交試驗，因素水平見表1。正交試驗中，以蓮子紅皮蛋白提取率作為工藝優(yōu)化的指標(biāo)，結(jié)果見表2。

表1 微波鹽提蓮子紅皮蛋白工藝L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal array design

圖6 蓮子紅皮蛋白等電點Fig.6 Isoelectric point of proteins extracted from red skin of lotus seed

表2 微波鹽提蓮子紅皮蛋白工藝正交試驗方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

從表2可看出：影響蓮子蛋白提取率的因素順序(R值)依次為B(NaCl濃度)＞C(提取時間)＞A(料液比)＞D (提取溫度)。其中NaCl濃度對提取率的影響較為顯著。并可知微波鹽提法從蓮子紅皮中提取蛋白質(zhì)的最佳提取條件為A1B3C3D2。

2.3.2 驗證實驗

由于正交試驗所確定的最佳條件并未被包含在正交表的9個試驗中，為驗證結(jié)果，采用正交表中所包含的最優(yōu)結(jié)果A1B3C3D3與正交試驗最優(yōu)水平A1B3C3D2各平行實驗3次。驗證實驗結(jié)果顯示，以A1B3C3D3工藝條件提取所得蓮子紅皮蛋白平均提取率為84.54%，以A1B3C3D2工藝條件提取所得蓮子紅皮蛋白平均提取率為85.52%。所以最終確定A1B3C3D2為最優(yōu)微波鹽提蓮子紅皮蛋白條件，即料液比1:12(g/mL)、NaCl濃度0.20mol/L、提取時間20min、提取溫度35℃。

2.4 蓮子紅皮蛋白等電點測定結(jié)果

加酸至等電點是從提取液中分離蛋白的常用方法，它能確保提取液中蛋白質(zhì)最大量的沉淀。本研究選用直接加酸調(diào)節(jié)pH值的方法。將微波鹽提的蓮子紅皮蛋白提取液用0.01mol/L鹽酸調(diào)pH值分別為4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5，使蛋白質(zhì)沉淀，離心后取上清液進(jìn)行比色測定，吸光度最小的即為等電點，結(jié)果見圖6。

由圖6可見，pH4.9時，上清液的吸光度最小，所以此點即為蓮子紅皮蛋白質(zhì)等電點，故蓮子紅皮蛋白酸沉最佳pH值為4.9。在此pH值進(jìn)行酸沉，蓮子紅皮蛋白的沉淀率為35.96%。

2.5 蓮子紅皮蛋白收率和純度

經(jīng)測定和計算，采用本工藝從蓮子紅皮粉中提取蛋白，最終收率為30.75%，蛋白純度達(dá)83.67%。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)測定，蓮子紅皮二道粉中總蛋白的含量為17.65%，與市售干白蓮中總蛋白含量16.6%～24.9%[1-2,4-7]接近。采用微波輔助鹽提法提取蓮子紅皮蛋白，通過單因素試驗及正交試驗，確定蓮子紅皮蛋白最佳提取工藝條件為微波功率600W、料液比1:12(g/mL)，以0.20mol/L NaCl溶液為提取液在35℃提取20min并重復(fù)提取1次，在此條件下，蛋白提取率可達(dá)85.52%。通過實驗驗證，蓮子紅皮蛋白的等電點為pH4.9，此時蛋白的沉淀量最大，沉淀率為35.96%。用本方法從蓮子紅皮中提取蛋白，蛋白收率為30.75%，蛋白純度達(dá)83.67%。

本法提取步驟簡單可行，可適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需求。相比以白蓮為蛋白提取原料[13,15]，以蓮子紅皮粉為原料提取蓮子蛋白可大大降低原料成本，又避免了蓮子紅皮粉目前對環(huán)境造成的污染，同時還可削弱蓮子加工產(chǎn)業(yè)所存在的不安全因素。此法有望成為蓮子深加工和綜合利用的又一條新途徑。

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Optimization of Microwave-assisted Salt-extraction of Proteins from Red Skin of Locus Seed

XU Hong，WANG Xin-yi，CAO Yang，SONG Huan-lu
(Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Red skin seeds of lotus usually produce about 15% of red skin powder in the resurfacing process. It was determined that protein content in red skin of lotus seed is 17.65%. In the present study, the conditions for the salt-extraction of proteins from red skin of lotus seed assisted by microwave, such as the ratio of solid to liquid (m/V), the concentration of NaCl solution, extraction temperature, extraction time and the repeat times of extraction, were investigated using the extraction rate of protein as an evaluation index. On the basis of single factor and orthogonal array design investigations, the optimal extraction conditions were obtained as follows: under the assistance of 600 W microwave irradiation twice-repeated extraction at 35 ℃ for 20 min each time at a ratio of solid to liquid 1:12 (g/mL). Under the above conditions, the extraction rate of protein was 85.52%. When HCl was used to precipitate protein, the precipitation rate of protein was 35.96% at an isoelectric point of pH 4.9. The yield and purity of lotus proteins extracted by this method were 30.75% and 83.67%, respectively. As a conclusion, lotus seed red skin has good development prospects.

red skin of lotus seed；protein；microwave-assisted salt-extraction

TS210.9

A

1002-6630(2011)04-0087-05

2010-10-06

徐虹(1977—)，女，講師，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：xuhong@th.btbu.edu.cn