趙林立,唐泰山,趙治國,王海艷,敖威華,劉 虹

(1.內(nèi)蒙古出入境檢驗檢疫局,內(nèi)蒙古呼和浩特 010020;2.江蘇出入境檢驗檢疫局,江蘇南京 210001)

呼和浩特地區(qū)牛羊布魯菌流行株種及生物型鑒定*

趙林立1,唐泰山2,趙治國1,王海艷1,敖威華1,劉 虹1

(1.內(nèi)蒙古出入境檢驗檢疫局,內(nèi)蒙古呼和浩特 010020;2.江蘇出入境檢驗檢疫局,江蘇南京 210001)

應(yīng)用常規(guī)細菌學(xué)方法,對呼和浩特部分地區(qū)疑似布魯菌病的牛、羊流產(chǎn)胎兒病料進行了布魯菌分離,共分離到4株布魯菌。進一步根據(jù)細菌形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化特性以及平板凝集試驗等對分離到的細菌進行種型鑒定。結(jié)果表明,其中3株為羊種布魯菌生物3型,1株為牛種布魯菌生物3型。本研究結(jié)果為內(nèi)蒙古地區(qū)布魯菌病的防控奠定了病原學(xué)基礎(chǔ)。

分離;鑒定;羊種布魯菌生物3型;牛種布魯菌生物3型

布魯菌病(Brucellosis)是由布魯菌屬(Brucella)的不同種布魯菌引起人及多種動物共患的細菌性傳染病,該病是世界動物衛(wèi)生組織(Office International des Epizooties,OIE)確定的必須報告的傳染病。在家畜中,牛、羊、豬布魯菌病時有發(fā)生[1],給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。由于該病可經(jīng)動物傳播給人類,故其在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義。多年來,我國所采取的以凈化為主的綜合性防控措施取得了一定效果,但近年來,人畜布魯菌病疫情在部分地區(qū)又有回升勢頭[2]。

布魯菌屬依據(jù)其表型和儲存宿主不同分為6個種、19個生物型[3]。調(diào)查顯示,我國主要流行的布魯菌有馬耳他布魯菌、流產(chǎn)布魯菌和豬布魯菌,雖然不同種具有一定的宿主選擇性,但不同動物之間的交叉感染也非常普遍,這給本病的防控帶來了較大的困難,因此,確定地區(qū)流行菌株的種和生物型,對豐富布魯菌病流行病學(xué)資料,查明感染來源,切斷傳染途徑等均十分重要。本試驗對采集于內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)牛羊養(yǎng)殖場的疑似布魯菌病的流產(chǎn)病料,進行了病原分離、鑒定及種型確定,為該地區(qū)布魯菌病的有效防控奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 從呼和浩特地區(qū)飼養(yǎng)場采集的5頭奶牛流產(chǎn)胎兒、3只綿羊流產(chǎn)胎兒。

1.1.2 儀器設(shè)備 生物安全柜為美國Nualre公司產(chǎn)品,生化培養(yǎng)箱為廣東醫(yī)療器械廠產(chǎn)品,光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.1.3 試劑 布魯菌瓊脂培養(yǎng)基、尿素酶活性試驗、糖發(fā)酵試驗、M R試驗、VP試驗、明膠液化試驗、檸檬酸鹽利用試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗、石蕊牛乳試驗等所需試劑及細菌生化鑒定管,均為北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品;布魯菌陽性和陰性血清及A、M、R因子血清均由內(nèi)蒙古地方病研究所饋贈。

1.2 方法

1.2.1 選擇性培養(yǎng)基的配制 布氏瓊脂培養(yǎng)基:分別稱取胰蛋白胨10.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母粉2.0 g、葡萄糖1.0 g、氯化鈉5.0 g、亞硫酸氫鈉0.1 g,加入1 000 mL蒸餾水,加熱溶解后調(diào)節(jié)pH至7.0,每100 mL培養(yǎng)基中加入放線酮10 mg,萬古霉素2 500 IU,多黏菌素600 IU,桿菌肽2 500 IU。

1.2.2 細菌的分離培養(yǎng) 無菌取5頭奶牛流產(chǎn)胎兒和3只流產(chǎn)羊胎兒的肝、脾、肺、胎衣,以及母體陰道分泌物,分別劃線接種于雙份布魯菌瓊脂培養(yǎng)基,1份置于普通大氣37℃培養(yǎng),另1份置于體積分數(shù)為5%～10%的CO2環(huán)境37℃培養(yǎng)3 d,如無菌落生長,則繼續(xù)培養(yǎng)7 d～15 d。取出培養(yǎng)皿,觀察菌落生長情況。對可疑菌落涂片并進行革蘭染色和改良柯氏染色[4],顯微鏡下觀察形態(tài),進一步用胰蛋白胨培養(yǎng)基(含50 mL/L犢牛血清)對其進行純化培養(yǎng),將不同來源的可疑菌進行編號標記。

1.2.3 生化試驗 按生化試驗管使用說明書對分離純化的細菌分別做尿素酶活性試驗、糖發(fā)酵試驗(葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖)、MR試驗、VP試驗、明膠液化試驗、檸檬酸鹽利用試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗及石蕊牛乳試驗。

1.2.4 血清學(xué)試驗 分別挑取純培養(yǎng)48 h后的疑似布魯菌菌落,利用布魯菌陽性血清和陰性血清作玻片凝集試驗,同時用生理鹽水做對照。結(jié)果判定方法如下:待菌體和抗血清混合1 min～2 min后,肉眼觀察是否出現(xiàn)凝集反應(yīng),出現(xiàn)凝集顆粒表明反應(yīng)呈陽性;不出現(xiàn)凝集顆粒表明反應(yīng)呈陰性。

1.2.5 種及生物型鑒定 將分離純化的布魯菌分別做染料抑制試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗、因子血清A、M、R凝集試驗以及噬菌體裂解試驗,詳細記錄試驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果

在雙料固體平板上培養(yǎng),該菌生長緩慢,初代培養(yǎng)完全形成菌落在3 d～7 d,在7 d之后形成明顯菌落,并在體積分數(shù)為5%～10%的CO2環(huán)境中容易生長。細菌經(jīng)傳代后,生長速度加快。固體培養(yǎng)物上形成S型菌落。菌落呈圓形、隆起、表面光滑,半透明狀,大小為1 mm～2 mm。分離純化后,染色結(jié)果顯示,該菌為革蘭陰性球桿菌,多數(shù)以單個存在,少有成雙或鏈狀排列,改良柯氏染色菌體呈紅色。

2.2 生化鑒定結(jié)果

對不同病料分離出的多株菌進行純培養(yǎng),并分別接種于各種生化培養(yǎng)基上,進行生化特性鑒定,結(jié)果表明,有4株菌符合布魯菌的生化特性[5](表1),被分別命名為 M3171、M3252、M3253和 A3313,其中M3171、M3252、M3253分離自綿羊流產(chǎn)胎兒,A3313分離于奶牛流產(chǎn)胎兒。

2.3 血清學(xué)試驗結(jié)果

血清學(xué)試驗結(jié)果表明,4株菌與陽性血清反應(yīng)均在1 min～2 min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng),而與布魯菌陰性血清均未出現(xiàn)凝集顆粒,呈陰性反應(yīng),與生理鹽水亦無無凝集現(xiàn)象。

2.4 菌種及生物型鑒定結(jié)果

利用染料抑制試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗、因子血清A、M、R凝集試驗對分離到的4株布魯菌進行種型鑒定,鑒定結(jié)果見表2。確定A3313為布魯菌牛種生物 3型;M3317、M3252、M3253為布魯菌羊種生物3型菌。

表1 疑似布魯菌生化鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical identification results of suspected Brucella

表2 布魯菌種和生物型鑒定結(jié)果Table 2 Species and type identifition results of Brucella strains

3 討論

布魯菌病是危害人、畜健康的重要細菌性傳染病,準確的病原診斷是有效防控該病的前提條件,其中病原分離和鑒定是該病準確診斷的經(jīng)典方法。本試驗通過奶牛和綿羊流產(chǎn)胎兒肝、脾、肺及母牛陰道分泌物等病料進行了病原菌的分離和鑒定。通過病料及培養(yǎng)物形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性、生化試驗、血清學(xué)試驗、布魯菌的種及生物型鑒定,分離獲得了4株布魯菌,其中分離于綿羊流產(chǎn)病料的3株布魯菌為羊種布魯菌生物3型;分離于奶牛流產(chǎn)病料的1株菌為牛種布魯菌生物3型,細菌學(xué)鑒定結(jié)果表明內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛和綿羊中存在牛種和羊種布魯菌,其鑒定結(jié)果不但豐富了本地區(qū)布魯菌病的流行病學(xué)資料,不同種及生物型的確定也為科學(xué)預(yù)防本病提供了重要依據(jù)。

布魯菌病的診斷有多種方法,常規(guī)方法包括血清凝集試驗、補體結(jié)合試驗、變態(tài)反應(yīng)性診斷以及細菌學(xué)檢查等,分子生物學(xué)方法包括 PCR擴增法、DNA同源性研究、NA限制性內(nèi)切酶圖譜分析、核酸探針檢測法等[6-9]。每種診斷方法各有特點,相互補充。其中,病原分離鑒定時間相對較長、敏感性較低,人員操作過程中又具有潛在的危險性,但因細菌學(xué)檢查的特異性強、準確性高而成為布魯菌檢查的經(jīng)典方法,且細菌學(xué)檢查也是進行病原特性研究的基礎(chǔ);分子生物學(xué)方法快速、準確,能夠降低人員感染的危險性。目前,布魯菌病法定的檢測方法仍然以病原學(xué)和免疫學(xué)為主,但隨著檢測技術(shù)的發(fā)展完善,分子生物學(xué)方法也會成為非常重要的檢測手段。

據(jù)統(tǒng)計[10],內(nèi)蒙古自治區(qū)除阿拉善盟外,有11個盟市53個旗縣分離到了布魯菌,其中羊種菌與牛種菌共棲的疫區(qū)有包頭市、呼和浩特市、呼倫貝爾盟、錫林郭勒盟;羊、牛、豬種菌共棲的疫區(qū)有哲里木盟;羊、牛、犬種菌共棲的疫區(qū)有赤峰市;其他為羊種菌疫區(qū)。20世紀 90年代以前,有羊、牛、豬、犬4個種 9 個生物型,即羊 1、2、3 型,牛 1、3、6、9 型,豬 1型和犬種菌,以及羊種和牛種的R型及非典型菌。本試驗在呼和浩特地區(qū)分離到的牛種和羊種布魯菌均為3型,與先前報道相一致。2008年,解英波等[11]在呼和浩特市、包頭市、通遼市、海拉爾市等地的奶牛中也分離到了布魯菌病,說明近年來動物布魯菌病的感染情況形勢嚴峻,人布魯菌病也時有報道。因此,對動物布魯菌病的研究和防控重在堅持、不能松懈,要做到早發(fā)現(xiàn)、早處理,在引進國外動物時應(yīng)加強檢疫監(jiān)管,將病畜杜絕于國門之外。

[1]Corbel M J.Recent advances in brucellosis[J].J Med Microbiol,1997,46:101-103.

[2]尚德秋.布魯氏菌病流行病學(xué)研究現(xiàn)狀[J].中華流行病學(xué)雜志,1998,19(2):107-110.

[3]Bowden R A,Cloeckaert A,Zygmunt M S,et al.Evaluation of immunogenicity and protective activity in BALB/c mice of the 25 kDa major Outer membrane protein ofBucella melitensis[J].J Med Microbiol,1998,47:36-48.

[4]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2002:36-42.

[5]黃海波.布魯氏菌病實驗室診斷技術(shù)[M].3版.北京:氣象出版社,1989.

[6]雷連成,陳 偉,王興龍,等.布魯氏菌鑒定和檢測方法研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2002,23(2):22-24.

[7]王勝昌,邵偉娟,謝建云,等.布氏桿菌 PCR檢測方法的建立[J].上海實驗動物科學(xué),2003,23(3):154-155.

[8]烏倫吉如嘎.奶牛布魯氏菌病病原分離及PCR快速檢測方法的研究[D].內(nèi)蒙古呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[9]唐瀏英,尚德秋,李元凱,等.應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測布氏菌抗原的研究[J].中國地方病防治雜志,1995,10(4):199-201.

[10]孫忠強,孫天志.內(nèi)蒙古布魯氏菌種型分布和變化[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)文獻信息,1997,3(3):205-206.

[11]解英波,姚 靜,烏日罕,等.內(nèi)蒙地區(qū)牛乳中布魯氏桿菌的分離鑒定[J].中國動物檢疫,2008,25(2):31-32.

Identification of Species and Type ofBrucellaEpidemic Strains in Huhhot

ZHAO Lin-li1,TANG Tai-shan2,ZHAO Zhi-guo1,WANG Hai-yan1,AO Wei-hua1,LIU Hong1

(1.Inner Mongolia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Huhhot,Inner Mongolia,010020,China;2.J iangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing,J iangsu,210001,China)

4 strains ofBrucellawere isolated from aborted fetuses of cattle and sheep which were suspected with brucellosis by conventional bacteriological methods.Based on bacterial morphology,cultural characteristics,biochemical characteristics,and the slide agglutination test and other test,the species and type ofBrucellastrains were identified.The results showed that 3 strains of 4 were biological type 3 ofBrucella ovis,1 strain was biological type 3 ofBrucella abortus.This study has laid an important basis in etiology for the prevention and control of brucellosis in Inner Mongolia.

isolation;identify;biological type 3 ofBrucella ovis;biological type 3 ofBrucella abortus

S852.614

A

1007-5038(2011)09-0034-03

2011-03-15

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2008IK004)

趙林立(1958-),女,河北人,研究員,主要從事食品微生物學(xué)及動物疫病快速檢測研究。