劉 波,郝永清,張愛榮,徐春光,范 鑫

(內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院,內蒙古呼和浩特 010018)

山羊傳染性胸膜肺炎病原的分離鑒定*

劉 波,郝永清*,張愛榮,徐春光,范 鑫

(內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院,內蒙古呼和浩特 010018)

從內蒙古地區(qū)山羊病料中分離出疑似山羊傳染性胸膜肺炎的病原,經染色鏡檢、生化鑒定、血清學等方法初步鑒定為山羊支原體山羊肺炎亞種。參照已知山羊支原體ADI基因設計的引物進行PCR擴增,通過電泳分析得到與文獻報道相一致的大小為316 bp的條帶,最終確定為山羊支原體山羊肺炎亞種。

山羊支原體山羊肺炎亞種;分離;ADI基因;鑒定

*通訊作者

山羊傳染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)是由支原體引起的山羊的一種接觸性傳染病,以高熱、咳嗽、精神萎靡為主要特征,發(fā)病率為22%～30%,有的地區(qū)高達60%～80%,死亡率為15%～30%。對世界各國的養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的損失,我國于1935年在內蒙古百靈廟地區(qū)曾流行過山羊的“爛肺病”。后來在山西、河北、山東、湖北、云南、江西、新疆以及內蒙等地均有本病的發(fā)生[1]。

山羊支原體山羊肺炎亞種(M.capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)是山羊傳染性胸膜肺炎的主要病原之一。由于其體外分離困難,直到1976年才由Macowan于肯尼亞分離到世界上第一株Mccp(命名為F38)并且驗證了其致病性。山羊支原體山羊肺炎亞種屬于絲狀支原體簇,除了Mccp外,還包括:山羊支原體山羊亞種(Mycoplasma capricolumsubspcapricolum,Mcc);絲狀支原體絲狀亞種 SC型,(Mycoplasma mycoidessubsp.mycoidesSC,MmmSC):絲狀支原體絲狀亞種 LC型(M.mycoides.subspmycoideslarge colony LC,MmmLC):絲狀支原體山羊亞種(M.mycoidessubsp.capri,Mmc):牛支原體第七群(Mycoplasmasubsp.bovinegroup 7,Mbg7)。我國學者辛九慶、李媛和張建華等[2]于2007年從山東分離出來一株Mccp,這是國內首次報道從臨床病例中分離到Mccp。

通常認為,絲狀支原體簇的分類鑒別生化試驗不能準確鑒定分離株;常規(guī)鑒定方法如生長抑制試驗、生長沉淀試驗、凝膠沉淀試驗、凝集試驗、補體結合試驗等檢測手段經常會出現(xiàn)一些非特異性反應或因為操作復雜等多種原因而不能準確的鑒定支原體肺炎亞種。因此,建立特異的分子生物學診斷方法對絲狀支原體簇菌株的鑒定有重要意義,可以為分子流行病學研究提供較為準確的診斷工具,并為該類疾病的環(huán)境適應性進化和基因組多態(tài)性研究奠定基礎,為不同地區(qū)該類疾病的預防和治療提供流行病學依據(jù)[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病山羊,為包頭市蒙興養(yǎng)殖公司疑似發(fā)病山羊50只。支原體基礎培養(yǎng)基,支原體培養(yǎng)基添加劑(購自OXOID)。山羊支原體山羊肺炎亞種標準株(PG3),購自中國獸藥監(jiān)察所。山羊支原體山羊肺炎亞種陽性血清,本實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集 通過觀察,選取癥狀典型的山羊進行撲殺,解剖,無菌采集肺部的病健交界處組織,肝臟的病健交界處組織和氣管。

1.2.2 病原的分離鑒定

1.2.2.1 分離培養(yǎng) 將采集的新鮮病料去除漿膜,取深層組織一小塊,用滅菌的手術剪將該組織完全剪碎,再加少量的生理鹽水混合均勻,將組織液分裝于1.5 mL的EP管2 000 r/min離心2 min～3 min,取上清1 mL、0.3 mL分別接種于支原體液體和固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由于支原體屬兼性厭氧菌,而且在體積分數(shù)為5%的CO2和一定的濕度環(huán)境中生長良好,本次培養(yǎng)采用“燭光”法,即在干燥器中放置蠟燭,并加少許無菌水以保持濕度,密封后37℃進行培養(yǎng)。每隔24 h觀察1次,如果發(fā)生污染,應及時用0.45 μ m的無菌濾器過濾繼續(xù)培養(yǎng)。一般將液體生長6 d～7 d的支原體通過對培養(yǎng)基顏色變化的觀察進行選取,將顏色變淺的菌株進行純化和傳代;固體培養(yǎng)基則通過顯微鏡的觀察,選取單個菌落,用手術刀摳取放入液體培養(yǎng)基中純化和傳代。重復該步驟3次～5次,最后將得到的單菌落培養(yǎng)物加100 mL/L的牛血清4℃保存[4]。

1.2.2.2 染色鏡檢 將疑似支原體菌株用姬姆薩染色、鏡檢。接種到固體培養(yǎng)基的支原體可在低倍顯微鏡下進行觀察。

1.2.2.3 生化鑒定 參照Freundt等的方法進行發(fā)酵葡萄糖試驗、水解精氨酸試驗、尿素分解試驗、美藍還原試驗、膜斑形成試驗、血清液化試驗、菌落吸附紅細胞試驗[5]。

1.2.2.4 血清學鑒定

疑似病羊血清的收集。采集疑似傳染性胸膜肺炎的山羊采血10 mL,擺斜面靜置30 min,無菌收集血清,置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

抗原的制備。將純培養(yǎng)的支原體在 4℃以12 000 r/min離心30 min,將沉淀用 PBS洗2次,然后超聲波200 W破碎10 min,取上清加20 g/L的色素,置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

凝集試驗。將制備的抗原與患病羊血清各25 μL滴到玻板上,充分混勻,5 min后觀察凝集現(xiàn)象。其中A組用病羊血清+抗原,B組用陽性血清+抗原,C組用陰性血清+抗原,D組用生理鹽水+抗原。

1.2.2.5 PCR鑒定

引物的合成。通過同源性比較發(fā)現(xiàn)山羊支原體山羊肺炎亞種GL100株的ADI基因在絲狀支原體簇中有一定的保守性,其多肽性在0.6%～3.5%波動,但其中差異最大的是編碼arcD基因,因此該基因可以區(qū)分絲狀支原體的簇的不同株。應用已有的針對山羊支原體山羊肺炎亞種的特異引物序列:Mccp-spe-F:5′-ATCATT TT TAATCCCT TCAAG-3′;Mccp-spe-R,5′-TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA-3′[6-7]。

DNA提取。取培養(yǎng)好的支原體50 mL,12 000 r/min離心 30 min,用 PBS洗滌 2次,收集沉淀,再以酚-氯仿法提DNA。

PCR反應體系及條件。按常規(guī)體系加TaqDNA 聚合酶 12.5 μL,DNA 模板 5 μL,上下游引物各 1 μL(5 μ mol/mL),最后加雙蒸水至總體積25 μL 。

擴增條件為:94℃預變性5 min;95℃變性30 s,57℃退火45 s,72℃延伸45 s,循環(huán)35次;最后72℃延伸10 min。

PCR擴增產物的分析。取擴增產物5 μL加入10 g/L的瓊脂糖凝膠點樣孔中,120 V,電泳 30 min,最后用凝膠成像儀觀察結果。

2 結果

2.1 分離培養(yǎng)

2.1.1 支原體在液體培養(yǎng)基生長情況 疑似菌在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d～6 d就可見培養(yǎng)基顏色變淺;同時做標準對照,但是標準菌株生長緩慢,培養(yǎng)基10 d才有輕微的變淺。

2.1.2 支原體在固體培養(yǎng)基生長情況 將疑似菌株接種于固體培養(yǎng)基,4 d～5 d長出菌落,菌落大小不一,大的直徑有0.8 cm,小的直徑只有0.2 cm～0.4 cm,典型煎蛋狀菌落較少;同時做標準對照:標準菌在選擇培養(yǎng)基上6 d～7 d才有菌落生長,并且菌落較大,呈典型煎蛋狀菌落

2.1.3 分離與純化 將典型單個菌落重復培養(yǎng)4次～5次,得到的單菌落培養(yǎng)物8株,分別為AM1 AM2、AM3、AM4 、AM5、AM6、PM1、PM2 在其固體培養(yǎng)基上可見大小較為均一的0.3 cm～0.5 cm的菌落,肉眼觀察典型的煎蛋狀菌落多為較小菌落。低倍鏡下觀察,可見小菌落也有煎蛋狀;與標準株的大小,形狀相似。

2.2 鑒定結果

2.2.1 臨床癥狀 主要病變表現(xiàn)為胸腔積水、肺部有出血或大范圍的蝦肉樣變、隔膜粘連等。

2.2.2 染色鏡檢 傳代生長穩(wěn)定的疑似菌株,革蘭染色不易著色,染色為陰性;瑞特、姬姆薩染色較好;油鏡下觀察可見長桿狀、球狀及多形性;多數(shù)菌體聚集排列在一處,少數(shù)菌體單個散在的存在,并且多為桿狀、長短不一(圖1);標準菌株染色特點與上述一致,鏡檢也與疑似菌株相似,但是其桿狀的較少、較短,且也多為散在存在。

圖1 分離株姬姆薩染色結果(1 000×)Fig.1 Giemas staining of the isolate(1 000×)

2.3 培養(yǎng)特性

接種固體培養(yǎng)基4 d～5 d開始生長,菌落平均大小為0.4 cm～0.6 cm,但只有零星的幾個,個別幾株為典型的煎蛋狀(圖2);與標準菌株基本一致。

圖2 標準株固體培養(yǎng)基菌落形態(tài)(40×)Fig.2 T he colonial morphology on solid medium(40×)

2.4 生化鑒定結果

結果見表1。

表1 分離菌株生化鑒定結果Table 1 T he results of biochemical idenfication of the nine isolates

2.5 血清學鑒定結果

結果見表2。

表2 分離株血清學試驗結果Table 2 The results of serological test of the nine isolates

2.6 PCR結果

將PCR產物進行電泳分析,結果得到了大小為316 bp的條帶,與預期的條帶大小一致(圖3)。

圖3 PCR擴增產物電泳圖Fig.3 The results of agarose gel electrophoresis of PCR products

3 討論

3.1 山羊支原體肺炎亞種的分離培養(yǎng)

Mccp能在人工培養(yǎng)基上生長,這一點與細菌相同,但其營養(yǎng)要求及培養(yǎng)條件苛刻。由于Mccp的基因組很小,其生物合成能力較低,生長需要外源性膽固醇、核酸前體、維生素等。

病料的污染程度及病料中的Mccp的含量對于Mccp分離成功與否有重要的影響。本試驗培養(yǎng)基添加劑中雖然加入了青霉素和醋酸鉈,但培養(yǎng)過程中個別仍有污染。也有多份病料未分離到Mccp,分析原因,可能病料本身無Mccp,還可能因為在采集病料之前對病羊進行過藥物治療而影響分離結果。

初次分離Mccp需培養(yǎng)較長的時間才能觀察到菌落生長,且由于Mccp菌落極小,所以培養(yǎng)5 d后應每日仔細觀察其生長狀況,至少持續(xù)1周,以免將剛長出微小菌落的培養(yǎng)基誤作廢棄處理。

3.2 關于Mccp的鑒定

通過形態(tài)及培養(yǎng)特征、常規(guī)生化鑒定及血清學鑒定,可對Mccp分離株作出比較準確的鑒定,但這些方法均存在假陽性、操作繁瑣、費時等缺點。

大量的試驗證明用PCR技術可檢測到極微量的支原體DNA,其方法快速、簡便、特異且敏感。同時PCR方法對支原體感染的早期診斷有重要的意義,而引物選擇是PCR檢測特異性和敏感性的關鍵。本試驗所選引物有高度的特異性,它能區(qū)分絲狀支原體簇的不同株,從分子生物學上鑒定了山羊支原體山羊肺炎亞種。

[1]儲岳峰,趙 萍,高鵬程,等.從山羊中檢測山羊支原體山羊肺炎亞種[J].江蘇農業(yè)學報,2009,25(6):1442-1444.

[2]辛九慶,李 媛,張建華,等.一株山羊支原體山羊肺炎亞種的分離鑒定與分子特征[J].中國預防獸醫(yī)學報,2007,29(4):243-248.

[3]杜永鳳,文心田,曹三杰,等.山羊傳染性胸膜肺炎病原分離鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報,2006,28(6):618-621.

[4]程光勝.山羊傳染性胸膜肺炎病原分離及診斷方法[D].重慶:中國優(yōu)秀碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫,西南大學,2006.

[5]李 媛,陶 岳.湖羊肺臟中分離綿羊肺炎支原體的鑒定[J].中國預防獸醫(yī)學報,2006,28(4):375-379.

[6]Li Y,Zhang J H,Hu S P,et al.Reclassification of the four China isolated strains of the pathogen for contagious caprine pleuropneumonia[J].Wei Sheng Wu Xue Bao,2007,47(5):769-773.

[7]Woubit S,Lo renzon S,Peyraud A,et al.A specific PCR for the identification of My coplasma capricolum subsp.capripneumoniae,the causative agent of contagious caprine pleuropneumonia(CCPP)[J].Vet Microbiol,2004,104(1/2):125-132.

Isolation and Identification of the Pathogens of Caprine Contagious Pleuropneumonia

LIU Bo,HAO Yong-qing,ZHANG Ai-rong,XU Chun-guang,FAN Xin

(College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia010018)

The pathogens were isolated from samples collected from goats probably infected with pleuropneumonia in Inner Mongolia.According to their morphological,physiological,biochemical,and serological characteristics, the strains were identified preliminarily asMycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae.A specific polymerase chain reaction was developed for identification,which specific primer pairs were designed on the basis of the target genes coding for the arginine deiminase pathway(ADI).Agarose electrophoresis showed that the DNA fragment of 316bp was amplified,which was consistent with the report by some literatures.Finally,it was determined that the isolates belonged toMycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae.

Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae;isolate;ADI gene;identification

S852.62

A

1007-5038(2011)09-0076-05

2011-01-29

劉 波(1984-),男,陜西榆林人,碩士,主要從事山羊支原體的研究。