王云龍，李永超，昌靜峰，李玉林，王國強，鄧黎黎，陳冬煥，董彩文，孫新城，劉旺根，梁曉艷

（1.河南工業(yè)大學，河南鄭州 450001；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學院，河南鄭州450121；3.河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450001）

人脂聯(lián)素原核表達純化及活性檢測

王云龍1，2，李永超1，昌靜峰3，李玉林3，王國強3，鄧黎黎3，陳冬煥3，董彩文3，孫新城3，劉旺根3，梁曉艷3

（1.河南工業(yè)大學，河南鄭州 450001；2.鄭州職業(yè)技術(shù)學院，河南鄭州450121；3.河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南鄭州450001）

為了克隆人脂聯(lián)素基因（ACRP30），獲得有免疫活性的重組人脂聯(lián)素，以人皮下脂肪組織為材料，提取總RNA，通過RT－PCR得到ACRP30基因。構(gòu)建重組質(zhì)粒pET－CKS－ACRP30，轉(zhuǎn)化表達菌BL21（DE3），以IPTG誘導表達人脂聯(lián)素重組蛋白，利用鎳親和層析純化，Western blot鑒定其活性，雙抗體夾心法檢測其免疫活性。獲得了人脂聯(lián)素基因，表達純化了人脂聯(lián)素融合蛋白，融合蛋白分子質(zhì)量約為50ku，表達量約占菌體總蛋白的30%，純度達到90%，雙抗體夾心法檢測重組蛋白具有免疫活性。本研究成功表達了人脂聯(lián)素重組蛋白且表達產(chǎn)物具有免疫活性，為人脂聯(lián)素檢測技術(shù)的建立奠定了基礎(chǔ)。

人脂聯(lián)素；原核表達；免疫活性

脂聯(lián)素（adiponectin）是由脂肪細胞分泌的一種細胞因子，具有抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和糖代謝、增加胰島素敏感性、抑制肝糖產(chǎn)生、抑制反饋TNF－α的生成與釋放，對損傷的肝細胞有重要的保護［1－3］。

脂聯(lián)素是由244個氨基酸組成的膠原樣蛋白，分子質(zhì)量為30ku，故其基因又命名為ACRP30（adipocyte complement－related protein of 30ku）［4］。人脂聯(lián)素基因位于染色體3q27，全長約17kb，由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成［5］。研究發(fā)現(xiàn)肥胖者和Ⅱ型糖尿病患者血漿脂聯(lián)素水平明顯降低，說明脂聯(lián)素與肥胖、胰島素抵抗和Ⅱ型糖尿病有著密切聯(lián)系，具有潛在的降糖、抗動脈粥樣硬化以及抗炎效應(yīng)［6］。

本研究以人脂肪組織為材料通過RT－PCR擴增出ACRP30全長片段，將ACRP30基因與表達載體pET－CKS連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET－CKS－ACRP30轉(zhuǎn)化大腸埃希菌表達。載體pET－CKS含有His標簽，為ACRP30重組蛋白的純化提供了條件。對表達的重組蛋白免疫活性進行檢測，為進一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

正常人脂肪組織來自河南省腫瘤醫(yī)院非糖尿病人；克隆菌TOP10F′、表達載體pET－CKS及表達菌BL21（DE3）、組織總 RNA提取試劑盒、RT－PCR試劑盒、DNA回收試劑盒、Taq酶等由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；脂聯(lián)素標準品為惠安生物科技有限公司產(chǎn)品；人脂聯(lián)素抗體、人脂聯(lián)素酶標抗體為R＆D system公司產(chǎn)品。

PCR引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。上游引物：5′－CGGGATCC GCTAGC ATGCTGTTGCTGGGAGCTGTT－3′，下劃線分別為BamHⅠ和NheⅠ酶切位點；下游引物：5′－CGGAATTC CTCGAG GTTGGTGTCATGGTAGAGAAGAA－3′，下劃線分別為EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及RT－PCR 將人新鮮脂肪組織約200mg加入少量液氮充分碾磨均勻，提取總RNA，置－20℃保存［7］。取2μL總 RNA用 RTPCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄、擴增，PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃ 5min。15g/L 瓊脂糖電泳，按照DNA回收試劑盒說明回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2 pET－CKS－ACRP30表達載體構(gòu)建及鑒定

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ分別酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET－CKS，并用DNA膠回收試劑盒分別回收ACRP30基因和線性化的載體片段。按載體與目的基因摩爾數(shù)1∶3～1∶8比例進行連接，T4連接酶連接16℃過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)TOP10F′，在LB平板（氨芐青霉素100mg/L、四環(huán)素5mg/L）上37℃過夜培養(yǎng)后，隨機挑選3個菌落進行PCR鑒定。選擇PCR陽性菌落，液體培養(yǎng)18 h，然后提取質(zhì)粒，EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒寄送上海博尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 人脂聯(lián)素ACRP30在大腸埃希菌中的誘導表達 經(jīng)測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌BL21（DE3），挑取單菌落轉(zhuǎn)接于3mL LB液體培養(yǎng)基（加有氨芐青霉素30mg/L，四環(huán)素5mg/L）中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。分別取30μL菌液于4支3mL LB液體培養(yǎng)基中，1支為未誘導的空白對照，另3支誘導樣品。37℃，200r/min搖床培養(yǎng)至OD600nm約為0.6～0.7時，加IPTG至終濃度為0.05mmol/L，其中1支37℃振蕩培養(yǎng)5h，1支30℃振蕩培養(yǎng)8h，1支25℃振蕩培養(yǎng)12h。誘導結(jié)束后取出立即冰浴10min，5 000r/min離心10min收集菌體，超聲波破菌后取上清和沉淀分別進行SDS－PAGE分析。

1.2.4 表達產(chǎn)物的 Western blot檢測 誘導后的表達產(chǎn)物經(jīng)100g/L SDS－PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜（NC膜）上。50g/L脫脂奶粉封閉后，PBST洗膜5次，加1∶1 000稀釋的人脂聯(lián)素酶標抗體，室溫振蕩30min，NC膜用PBST洗5次后轉(zhuǎn)移到10mL DAB溶液中，加入H2O2，室溫避光輕搖3min顯色。

1.2.5 表達產(chǎn)物的純化 取陽性菌株37℃下進行大量培養(yǎng)，超聲波破菌后離心收集包涵體，包涵體用TritonX－100洗1遍，用8mol/L尿素溶解。用鎳親和層析柱純化，依次用含20、50、100 、200mmol/L咪唑的（8mol/L）尿素緩沖液洗脫，純化后進行SDS－PAGE分析。用凝膠薄層掃描軟件分析蛋白純度。留取濃度較高的蛋白質(zhì)溶液采用文獻［8］的方法復性。

1.2.6 雙抗體夾心法檢測產(chǎn)物活性 依據(jù)產(chǎn)品說明書將脂聯(lián)素抗體按1∶500稀釋后包被到96孔酶標板上并封閉。將標準品（300ng/mL）、血清（分別稀釋500、1 000、2 000倍）和純化產(chǎn)物（重組人脂聯(lián)素分別稀釋5、10、20、40倍）50μL/孔分別加入1號～8號孔，空白孔加入100μL樣品稀釋液，再加入酶結(jié)合物50μL/孔；混勻，37℃反應(yīng)1h。洗板后，加入顯色劑A和顯色劑B各50μL/孔，37℃反應(yīng)20 min。加入終止液100μL/孔，酶標儀上用450nm和630nm雙波長檢測各孔的OD值（重復本試驗2次，取檢測的平均值）。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR結(jié)果

以人脂肪組織為材料提取RNA，通過RT－PCR獲得了750bp的ACRp30基因片段（圖1）。

圖1 ACRP30片段PCR結(jié)果Fig.1 Identification ACRP30DNA of RT－PCR

2.2 菌落PCR鑒定結(jié)果

轉(zhuǎn)化子pET－CKS－ACRP30采用菌落PCR初步鑒定，3個菌落均為陽性（圖2）。

圖2 重組質(zhì)粒pET－CKS－ACRP30菌落PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pET－CKS－ACRP30

2.3 重組pET－CKS－ACRP30原核載體酶切鑒定結(jié)果

隨機挑取菌落PCR為陽性的菌落搖菌，提取質(zhì)粒后進行BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，可見750bp的ACRp30片段（圖3）。

2.4 重組pET－CKS－ACRP30原核載體測序結(jié)果

將測序結(jié)果與GenBank收錄的ACRP30進行比對，與GenBank上公布的序列（序列號NM－004797.2）同源性達到99%以上。

2.5 重組pET－CKS－ACRP30的表達及可溶性分析

分別取25℃（12h）、30℃（8h）、37℃（5h）誘導的菌體上清及沉淀進行SDS－PAGE電泳（圖4），沉淀中較未誘導菌新增一條蛋白條帶，其相對分子質(zhì)量約50ku，與預(yù)期目的蛋白分子質(zhì)量相符。但3個溫度下，蛋白濃度無明顯差異。考馬斯亮藍染色并經(jīng)凝膠成像儀掃描，目的蛋白約占菌體總蛋白量的30%。

圖3 重組質(zhì)粒pET－CKS－ACRP30酶切鑒定Fig.3 Identification of pET－CKS－ACRP30 by restriction enzyme digestion

圖4 SDS－PAGE分析pET－CKS－ACRP30在不同條件下的表達Fig.4 Expression of pET－CKS－ACRP30under different conditions analyzed by SDS－PAGE

2.6 表達產(chǎn)物Western blot鑒定

利用人脂聯(lián)素酶標抗體檢測目的蛋白，證明所分離的蛋白是人脂聯(lián)素的融合蛋白，且SDS－PAGE結(jié)果所示分子質(zhì)量與預(yù)測大小相符，故得到的表達產(chǎn)物是目的蛋白（圖5）。

2.7 目的蛋白純化

pET－CKS多克隆位點上游有CKS－tag，下游有His－tag，30ku的ACRP30與兩個標簽融合表達構(gòu)成的重組蛋白分子質(zhì)量約50ku。包涵體經(jīng)8 mol/L尿素溶解、鎳離子親合層析純化，SDS－PAGE電泳（圖6）證實純化產(chǎn)物為單一蛋白，凝膠掃描顯示純度約為90%，且100mmol/L咪唑洗脫液中蛋白濃度最高。

圖5 重組蛋白的免疫印跡分析Fig.5 Analysis of recombinant protein by Western blot

圖6 SDS－PAGE分析表達產(chǎn)物純化Fig.6 Purification of expressed products adiponectin analyzed by SDS－PAGE

2.8 免疫活性鑒定

雙抗體夾心法檢測試驗（取3次檢測結(jié)果平均值，表1）表明，雖然重組人脂聯(lián)素比人血清中的脂聯(lián)素活性低，但可以用作免疫原，用于人脂聯(lián)素多抗和單克隆抗體制備。

表1 雙抗體夾心ELISA檢測重組人脂聯(lián)素結(jié)果Table 1 The result of double antibody sandwich ELISA for recombinant human adiponectin

3 討論

本研究從人脂肪細胞中提取RNA，經(jīng)過RTPCR獲得了人脂聯(lián)素基因，與原核表達載體pETCKS進行重組，經(jīng)測序后，與GenBank（登錄號NM－004797.2）上公布的序列僅有1個核苷酸不同，引起此單核苷酸差異的原因可能如下：人與人之間的單核苷酸多態(tài)性；PCR過程中Taq酶的保真性不好，造成突變；在轉(zhuǎn)化宿主菌后，培養(yǎng)過程中大腸埃希菌發(fā)生突變。但經(jīng)DNA Ssist軟件分析，表達的蛋白氨基酸序列完全相同。

目前人脂聯(lián)素重組抗原、抗人脂聯(lián)素單克隆抗體及多克隆抗體的制備報道很多［9］，但多數(shù)存在表達量低下，或生物活性受影響，或純度不理想等問題。本研究使用pET－CKS表達載體采用T7啟動子和蛋白質(zhì)工程改造過CKS基因融合表達，選用人鼻病毒14亞型3C蛋白酶專一性酶切位點，可將CKS融合標簽去除。表達載體pET－CKS帶有6個組氨酸的標簽，可以用鎳親和柱收集，利于蛋白純化與鑒定［10］。本研究獲得的人脂聯(lián)素雖然比標準品的活性稍低，但是能夠滿足脂聯(lián)素檢測試劑盒中所用標準品的要求。因此，本研究通過原核表達系統(tǒng)獲得純度較高且有免疫活性重組人脂聯(lián)素蛋白，為制備人脂聯(lián)素單克隆抗體和開發(fā)脂聯(lián)素檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

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Prokaryotic Expression and Purification of Human Adiponectin and Its Immunological Activity Detection

WANG Yun－long1，2，LI Yong－chao1，CHANG Jing－feng3，LI Yu－lin3，WANG Guo－qiang3，DENG Li－li3，CHEN Dong－h(huán)uan3，DONG Cai－wen3，SUN Xin－cheng3，LIU Wang－gen3，LIANG Xiao－yan3
（1.HenanUniversityofTechnology，Zhengzhou，Henan，450001；2.ZhengzhouTechnicalCollege，Zhengzhou，Henan，450121，China；3.HenanBiotechnologyResearchCenter，Zhengzhou，Henan，450001，China）

To clone the human adiponectin（ACRP30）cDNA and obtain the recombinant adiponectin with immunological activity，fresh human fat tissue was used for extracting total RNA and amplificating the adiponectin cDNA through RT－PCR.The recombinant plasmid pET－CKS－ACRP30was constructed and confirmed，and it was transduced into BL21（DE3）.Then the transformation was used for induced expression.The recombinant protein was identified by Western blotting and purified by Ni affinity chromatography.Finally，the sandwich ELISA method was developed for detecting the immunological activity of human adiponectin.Human adiponectin was expressed and purified，and the target protein is about 30%of the total bacterial protein，and the purity is around 90%.It is domenstrated that the aim protein has immunological activity with the sandwich ELISA.Adiponectin with immunological activity has been obtained from prokaryotic expression，which lays a foundation for establishing the detection method of human adiponectin.

human adiponectin；prokaryotic expression；immunological activity

Q789

A

1007－5038（2011）10－0036－04

2011－04－01

河南省科技創(chuàng)新團隊和鄭州市科技創(chuàng)新團隊資助項目

王云龍（1962－），男，河南洛陽人，教授級高級工程師，主要從事生物工程技術(shù)研究。