林居純，鄢榮梅，曹三杰，魏 峰，文心田＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安625014；2.動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川雅安652014）

三聚氰胺對(duì)小鼠的急性毒性和蓄積毒性研究

林居純1，2，鄢榮梅1，曹三杰1，魏 峰1，文心田1＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安625014；2.動(dòng)物疫病與人類(lèi)健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川雅安652014）

為評(píng)價(jià)三聚氰胺的毒性作用，進(jìn)行了三聚氰胺急性毒性和蓄積毒性研究。小鼠急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)為7個(gè)劑量組和1對(duì)照組，組間劑量比為0.65，每組10只小鼠，觀察小鼠1周內(nèi)的中毒表現(xiàn)，病理解剖及病理組織學(xué)變化，并計(jì)算三聚氰胺LD50及95%可信限。蓄積毒性試驗(yàn)以固定劑量（1/3LD50）連續(xù)染毒法，以蓄積系數(shù)評(píng)價(jià)其蓄積毒性。結(jié)果顯示，小鼠三聚氰胺急性中毒主要表現(xiàn)為活動(dòng)減少，呼吸急促，食欲降低等。小鼠死亡集中在染毒后42h～72h內(nèi)。除腎臟外，小鼠肺、肝及脾均有眼觀損害及組織病理學(xué)變化。三聚氰胺小鼠經(jīng)口急性毒性 LD50為2 958.69mg/kg，LD5095%可信限為2 187.00mg/kg～3 981.07 mg/kg。蓄積毒性試驗(yàn)的蓄積系數(shù)為4。參照我國(guó)食品安全性急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，三聚氰胺為低毒物質(zhì)，有中度蓄積毒性，可造成腎、肺、肝及脾等內(nèi)臟器官的損害。

三聚氰胺；急性毒性；蓄積毒性；小鼠

＊通訊作者

三聚氰胺（melamine）作為一種化工原料廣泛用于塑料、涂料及黏合劑等生產(chǎn)。由于其含氮量高達(dá)66.7%，故被一些不法分子添加到乳品、飼料等中虛假夸大蛋白含量。繼2007年美國(guó)報(bào)道寵物食品中摻雜三聚氰胺導(dǎo)致約4 000只貓、狗死亡以來(lái)，在其他國(guó)家和地區(qū)的飼料中也檢出三聚氰胺［1］。2008年在我國(guó)超過(guò)5萬(wàn)名嬰幼兒因食用含三聚氰胺奶粉而患尿路結(jié)石，6名嬰兒死于腎衰竭［2］。三聚氰胺事件引起了全世界對(duì)三聚氰胺毒性的研究。急性毒性研究顯示，三聚氰胺毒性作用靶器官是泌尿系統(tǒng)，對(duì)其他臟器未發(fā)現(xiàn)明顯的損害［3］。有關(guān)三聚氰胺的蓄積毒性，以及在急性毒性試驗(yàn)中是否對(duì)其他臟器造成損害尚未見(jiàn)報(bào)道，為此本研究通過(guò)小鼠急性及蓄積毒性試驗(yàn)，觀察三聚氰胺對(duì)小鼠內(nèi)臟器官的損害作用，為長(zhǎng)期毒性、特殊毒性研究和動(dòng)物中毒治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，清潔級(jí)，健康，體重為18g～22g，雌雄各半，購(gòu)自四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 試劑 三聚氰胺（純度≥98.5%）為成都市科龍化工試劑廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果得知，三聚氰胺小鼠灌胃0%及100%死亡劑量估量值分別為1 000mg/kg，15 000mg/kg。正式試驗(yàn)劑量組設(shè)為7組，組間劑量比為0.65。按體重隨機(jī)分組法將小鼠分為8組，10只/組，雌雄各半。1組～7組為染毒組，第8組為蒸餾水對(duì)照組，灌胃染毒。染毒后記錄1周內(nèi)小鼠的中毒表現(xiàn)，死亡情況及病理學(xué)變化，三聚氰胺LD50及LD5095%可信限按改良寇氏法計(jì)算［4－5］。

1.2.2 蓄積毒性試驗(yàn) 按體重隨機(jī)分組法將80只小鼠分為2組，40只/組，雌雄各半。試驗(yàn)組小鼠每天按1/3LD50的固定劑量連續(xù)灌胃染毒，對(duì)照組灌服蒸餾水。在試驗(yàn)期內(nèi)觀察記錄動(dòng)物死亡數(shù)，當(dāng)試驗(yàn)組動(dòng)物累計(jì)死亡達(dá)50%，結(jié)束試驗(yàn)。計(jì)算蓄積系數(shù)（K）＝LD50（n）/LD50（1），并對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中LD50（n）為固定劑量引起受試動(dòng)物半數(shù)死亡的累計(jì)劑量，LD50（1）為1次染毒引起動(dòng)物半數(shù)死亡的劑量［4］。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 中毒表現(xiàn)及死亡情況 小鼠經(jīng)口染毒6h后，表現(xiàn)為活動(dòng)減少，精神萎靡，閉眼伏臥，呼吸急促，飲水量及采食量減少等癥狀。42h后最高劑量組小鼠發(fā)生死亡，隨后各劑量組小鼠陸續(xù)死亡，死亡集中在染毒后42h～72h，耐過(guò)72h的小鼠不再死亡，但其精神狀態(tài)較差，飲水量和采食量減少。對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)，攝食及活動(dòng)未見(jiàn)異常，無(wú)死亡小鼠。三聚氰胺急性毒性試驗(yàn)小鼠死亡情況見(jiàn)表1。改良寇氏法計(jì)算三聚氰胺小鼠經(jīng)口急性毒性LD50為2 958.69mg/kg，LD5095% 可 信 限 為2 187.00 mg/kg～3 981.07mg/kg。

表1 三聚氰胺急性毒性實(shí)驗(yàn)死亡動(dòng)物數(shù)Table 1 Number of dead mice in acute toxicity test of melamine

2.1.2 小鼠病理學(xué)變化 中毒死亡及試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活的小鼠全部處死后做大體解剖，剖檢可見(jiàn)小鼠肺臟表面有出血斑，部分小鼠肺臟萎縮，表面有白色結(jié)節(jié)；脾臟體積縮小，脾邊緣有黑紅色出血斑；肝臟腫大，肝表面有樹(shù)枝狀或細(xì)小長(zhǎng)條形出血斑；腎臟腫大，充血出血。上述病變的嚴(yán)重程度隨染毒劑量的降低而有所減輕。此外，第1組小鼠膀胱內(nèi)有大量結(jié)石，輸尿管有晶體沉積，隨著劑量的降低，結(jié)石量減少，較低劑量組（第6、7組）小鼠膀胱內(nèi)無(wú)結(jié)石，但可觀察到結(jié)晶尿。其他器官未見(jiàn)眼觀病變。

組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)所有染毒組小鼠肺臟、肝臟、脾臟及腎臟均有病理組織形態(tài)學(xué)變化，而對(duì)照組小鼠組織形態(tài)無(wú)異常變化。圖1為1 690mg/kg染毒組小鼠組織器官的病理組織變化。

圖1 三聚氰胺急性毒性試驗(yàn)小鼠病理組織學(xué)變化（HE）Fig.1 Histopathological lesions of mice in acute toxicity test of melamine（HE）

2.2 蓄積毒性試驗(yàn)結(jié)果

小鼠每天按986.33mg/kg（1/3LD50）染毒劑量連續(xù)染毒，當(dāng)試驗(yàn)進(jìn)行到第12天時(shí)，累計(jì)死亡小鼠數(shù)達(dá)總動(dòng)物數(shù)的50%（20只/40只），而分次染毒累計(jì)劑量為4LD50，故三聚氰胺的蓄積毒性系數(shù)（K）為4。

3 討論

2004年－2007年寵物飼料因污染三聚氰胺導(dǎo)致貓狗急性中毒主要表現(xiàn)為厭食、嘔吐、嗜睡、多尿、氮質(zhì)血癥、高磷酸鹽血癥等腎病癥狀，動(dòng)物最終死于尿毒癥。死亡動(dòng)物腎遠(yuǎn)曲小管損傷，遠(yuǎn)曲小管和集合管有扇形輻射狀結(jié)晶沉積，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生壞死和增生［1］。嚙齒類(lèi)動(dòng)物急性毒性研究表明，大鼠經(jīng)口急性毒性LD50為3 161mg/kg［6］。小鼠急性毒性研究顯示，20 000mg/kg劑量組小鼠給藥9h后出現(xiàn)不安，呼吸急促，隨后在幾十分鐘內(nèi)發(fā)生死亡，其余組小鼠僅表現(xiàn)為精神不振，廢食等。死亡小鼠輸尿管有大量晶體蓄積，部分小鼠腎臟被膜有一層晶體，其他臟器未見(jiàn)有明顯的變化［3］。

本試驗(yàn)經(jīng)統(tǒng)計(jì)急性毒性試驗(yàn)小鼠死亡率，計(jì)算出三聚氰胺小鼠經(jīng)口急性毒性LD50為2 958.69 mg/kg，LD50的95%可信限為2 187.00mg/kg～3 981.07mg/kg，與報(bào)道的大鼠 LD503 161mg/kg非常接近。據(jù)我國(guó)食品安全性急性毒性劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［5］，三聚氰胺屬低毒級(jí)物質(zhì)。盡管三聚氰胺屬低毒級(jí)，但其蓄積系數(shù)4，表明其在體內(nèi)有中度蓄積毒性，說(shuō)明三聚氰胺或其代謝產(chǎn)物能在機(jī)體內(nèi)蓄積造成對(duì)機(jī)體的損害。

本次三聚氰胺小鼠灌胃急性毒性試驗(yàn)各染毒組小鼠均有食欲，飲水量減少，呼吸急促等中毒表現(xiàn)，與其他有關(guān)小鼠急性中毒癥狀相似［3］。小鼠病理剖檢觀察到小鼠腎臟腫大，表面有出血斑，并未觀察到小鼠腎臟被膜有晶體存在，但在膀胱、輸尿管發(fā)現(xiàn)結(jié)石或結(jié)晶，說(shuō)明了泌尿系統(tǒng)是三聚氰胺的毒性作用的靶器官。急性毒性試驗(yàn)經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)，均觀察到小鼠的肺、肝及脾有相似的病理變化，說(shuō)明三聚氰胺除對(duì)泌尿系統(tǒng)有損傷作用外，對(duì)肺臟、肝臟和脾臟也有毒性作用。這是首次報(bào)道三聚氰胺經(jīng)口急性毒性會(huì)造成對(duì)其他內(nèi)臟的損害。

組織病理學(xué)觀察顯示各染毒劑量組均有形態(tài)學(xué)變化。腎臟主要表現(xiàn)為腎小球因毛細(xì)血管充血而增大，腎小管上皮腫脹，未觀察到貓、狗急性中毒時(shí)的腎遠(yuǎn)曲小管和集合管的扇形結(jié)晶和小管上皮的壞死和增生［1］，以及亞急性毒性實(shí)驗(yàn)中觀察到的貓、大鼠腎小管上皮壞死及管腔內(nèi)的晶體［3，7－8］?？赡艿脑蚴潜敬卧囼?yàn)甲醛固定病理組織材料時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成三聚氰胺及其形成結(jié)石溶解于甲醛［1］，故未能觀察到腎小管內(nèi)有晶體存在，只在遠(yuǎn)曲小管和集合管觀察到深藍(lán)色尿液。此外本試驗(yàn)還觀察到肺、肝及脾有嚴(yán)重的充血出血，肺泡壁增厚，肝臟細(xì)胞顆粒變性等形態(tài)學(xué)改變，說(shuō)明了肺、肝及脾臟也是三聚氰胺在體內(nèi)的毒性作用的靶器官。有研究表明注射三聚氰胺對(duì)肝臟有毒性作用［10］，20d喂養(yǎng)試驗(yàn)表明，除對(duì)大鼠腎外，三聚氰胺對(duì)肝、脾、肺也有損害，表現(xiàn)出肝細(xì)胞水樣變性及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，脾竇擴(kuò)張、瘀血，以及局部肺泡間隔增寬，肺泡腔有少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)［9］。

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Studies on the Acute and Accumulative Toxicity of Melamine in Mice

LIN Ju－chun1，2，YAN Rong－mei1，CAO San－jie1，WEI Feng1，WEN Xin－tian1，2

（1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Ya＇an，Sichuan，625014，China；2.KeyLaboratoryofAnimalDisease andHumanHealthofSichuanProvince，Ya＇an，Sichuan，625014，China）

To evaluate the toxicity of melamine to mice，the acute toxicity and the accumulative toxicity tests were carried out.The acute toxicity test was designed to 7experiment groups（r＝0.65）and 1control group，which consisted of 10mice.Toxic manifestations，gross lesions and histopathological lesions of mice，were observed during 7days acute exposure.LD50and 95%LD50confidence level of melamine were calculated by the modified Korbor method.The accumulative toxicity test was carried out by continuous exposure at a fixed dose（1/3LD50），the accumulative coefficient was calculated to appraise the accumulative toxicity of melamine.The acute toxic symptoms of mice were actively decreased，respiratory distress and anorexia.The death time of mice was within 42h－72h.Except for kidney，lung，liver and spleen of dead mice showed gross lesions and histopathological changes.The LD50of melamine to mice was 2 958.69 mg/kg，with 95%confidence interval of 2 187.00mg/kg－3 981.07mg/kg.The results of accumulative toxicity test showed that the accumulative coefficient K was 4.The results suggest that melamine is a kind of low toxic chemical according to food safety evaluation on toxicology in China，and possesses moderate accumulative toxicity in mice.The kidney，lung，liver and spleen are toxic targets of melamine in acute toxicity test.

melamine；acute toxicity；accumulative toxicity；mice

S859.8

A

1007－5038（2011）10－0047－04

2011－03－29

教育部"長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃"創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（IRT0848），四川省教育廳科研項(xiàng)目

林居純（1968－），女，四川隆昌人，博士，副教授，主要從事藥理與毒理學(xué)研究。