林 穎，耿慶華，付海濱，李俊環(huán)，閆明媚，李成鏞，林書銘

（1.沈陽出入境檢驗檢疫局，遼寧沈陽110016；2.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽110161）

犬細小病毒和犬冠狀病毒雙重PCR方法的建立及應用

林 穎1，耿慶華1，付海濱1，李俊環(huán)1，閆明媚2，李成鏞1，林書銘1

（1.沈陽出入境檢驗檢疫局，遼寧沈陽110016；2.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧沈陽110161）

根據(jù)GenBank中犬細小病毒（CPV）和犬冠狀病毒（CCV）基因序列各設計了一對引物，經(jīng)試驗條件的優(yōu)化，建立了檢測CPV的PCR方法和CCV的RT－PCR方法，擴增目的片段大小分別為337bp和852bp。在此基礎上建立了檢測CPV和CCV雙重PCR方法。該雙重PCR方法能特異的擴增CPV和CCV，且分別擴增出1.08ng和3.2ng總核酸量。通過檢測96份臨床樣品，對雙重PCR方法和膠體金試紙條方法進行了對比試驗。結果表明，建立的雙重PCR方法快速、敏感、特異性高，可以用于CPV和CCV鑒別檢測。

犬細小病毒；犬冠狀病毒；雙重PCR

犬細小病毒感染（Canine parvovirus infection）又稱犬傳染性出血性腸炎，是由犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的犬急性傳染病。CPV基因組為單股負鏈DNA［1］，臨床上多以出血性腸炎發(fā)生，如不及時治療大多以死亡為終結［2］。犬冠狀病毒性腹瀉（Canine coronavirus diarrhea）是由犬冠狀病毒（Canine coronavirus，CCV）引起的犬急性腸道性傳染病，病毒核酸為單股RNA。CPV與CCV引發(fā)疾病的臨床表現(xiàn)極為相似，且常發(fā)生混合感染，給鑒別診斷帶來困難［3－5］。多重PCR技術是在同一PCR體系中加入多對引物，對多個目的基因同時進行擴增的分子生物學診斷方法，可同時檢測多種病原體或多個基因型，達到對多種疾病的同步診斷，縮短檢測時間［6－8］。本試驗在單項PCR檢測方法基礎上，建立了雙重PCR方法，即一次可同時快速鑒別診斷CPV和CCV兩種病毒感染，為這兩種疾病提供快速診斷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和病料 美國富道四聯(lián)弱毒疫苗（含犬瘟熱病毒、犬細小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒，簡稱美國疫苗），法國梅里埃六聯(lián)弱毒疫苗（含犬瘟熱病毒、犬細小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬鉤端螺旋體和犬黃膽出血群，簡稱法國疫苗），吉林五星五聯(lián)弱毒疫苗（含狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、犬細小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒，簡稱吉林疫苗）。犬冠狀病毒，犬腎傳代細胞（MDCK）由沈陽農(nóng)業(yè)大學饋贈。病料為來源于12家動物醫(yī)院臨床病犬糞便樣品，共96份。

1.1.2 試劑 DNA 聚合酶、dNTP、RT－PCR反應試劑盒、DNA Marker 100bp Ladder、膠回收試劑盒等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Ambian磁珠試劑盒為北京吉泰生物技術有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 從GenBank中分別獲得5株CPV和2株CCV的全基因序列，利用生物軟件CLUSTALX進行序列比較分析。用Oligo 6設計CPV和CCV特異性引物，擴增CPV引物P1和P2，可擴增片段為337bp；擴增CCV引物C1和C2，可擴增 852bp。序列為 P1：5′－AAG ACG TGC AAG CGA GTC C －3′；P2：5′－GAG CGA AGA TAA GCA GCG TAA －3′。C1：5′ －AGA TGT TGC GTG TAT TGG T －3′；C2：5′－CCG AAA GCA GTC ATT GGT AT－3′。

1.2.2 病毒核酸的制備 分別將接種CCV的犬腎傳代細胞（MDCK）、美國疫苗、法國疫苗及吉林疫苗（吉林疫苗干粉加入1mL DEPC純水，充分溶解）用Ambion的磁珠核酸提取試劑盒提取病毒核酸。

1.2.3 CCV RT－PCR和CPV PCR方法的建立

1.2.3.1 CCV RT－PCR方法的建立 采用20μL的RT反應體系，25mmol/L MgCl22μL，10×RT－PCR buffer 2μL，10mmoL/L的dNTP 2μL，反轉錄酶抑制0.5μL，10U/μL的反轉錄酶 AMV 0.5 μL，CCV下游引物1μL，瞬間離心后，于42℃水浴中反應30min。以反轉錄產(chǎn)物為模板的PCR采用25μL擴增體系，并對各反應條件進行摸索，PCR反應后，取5μLPCR產(chǎn)物進行15g/L瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3.2 CPV PCR方法的建立 以分別提取的美國疫苗、法國疫苗，吉林疫苗的核酸為模板，PCR反應采用25μL反應體系，并對各反應條件進行摸索，PCR反應后，取5μL PCR產(chǎn)物進行15g/L瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3.3 PCR 產(chǎn)物的鑒定 CCV RT－PCR 和CPV PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后，送寶生物工程（大連）有限公司進行測序。

1.2.4 CCV和CPV雙重PCR方法的建立及產(chǎn)物鑒定 取法國疫苗及接種CCV的MDCK各25 μL，按照1.2.2方法提取核酸后進行反轉錄，20μL的RT反應體系，含25mmol/L MgCl22μL，10×RT－PCR buffer 1μL，10mmoL/L的dNTP 1μL，反轉錄酶抑制0.5μL，10U/μL的反轉錄酶AMV 0.5μL，CCV 下游引物0.5μL，瞬間離心后，置42℃水浴中反應30min。以反轉錄產(chǎn)物的cDNA和提取法國疫苗的核酸為模板進行雙重PCR，PCR采用25μL擴增體系，并對各反應條件進行摸索，PCR反應后，取5μL PCR產(chǎn)物進行15g/L瓊脂糖凝膠電泳。將擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化試劑盒純化后送寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.2.5 特異性檢測 提取美國疫苗、法國疫苗、吉林疫苗、接種CCV的MDCK和正常的MDCK的核酸用建立的雙重PCR方法擴增。

1.2.6 敏感性試驗 取吉林疫苗和CCV細胞毒、吉林疫苗和CCV細胞毒混合物的核酸，提取后用分光光度計測定核酸濃度，取5μL核酸加入到45μL蒸餾水中，再從中取出5μL進行倍比稀釋，依次為10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。分別做 PCR、RT－PCR和雙重PCR。

1.2.7 雙重PCR的初步應用及比對試驗 對96份犬糞便樣品采用CCV和CPV膠體金試紙條抗原檢測方法進行檢測和雙重PCR方法進行比對試驗。

2 結果

2.1 CCV RT－PCR擴增結果

經(jīng)對反轉錄及PCR反應過程中的退火溫度、延伸時間、循環(huán)次數(shù)等條件的優(yōu)化，確定最佳反應條件。反應體系為：10×PCR buffer 2.5μL、dNTP 2.5μL、上下游引物各0.5μL、Taq酶1μL、模板5 μL，去離子水補足25μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預變性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。反應產(chǎn)物擴增出特異性條帶852bp，與預期結果相符（圖1）。

2.2 CPV的PCR擴增結果

經(jīng)對PCR反應過程中的退火溫度、延伸時間、循環(huán)次數(shù)等條件的優(yōu)化，確定最佳反應條件。反應體系為：10×PCR buffer 2.5μL、dNTP 2.5μL、CCV上下游引物各0.5μL、Taq酶1μL、L、模板5 μL，去離子水補足25μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預變性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)后；72℃延伸10min。反應產(chǎn)物擴增出特異性條帶337bp，與預期結果相符（圖2）。

圖1 CCV RT－PCR擴增結果Fig.1 The results of CCV RT－PCR

圖2 CPV PCR擴增結果Fig.2 The results of CPV PCR

2.3 PCR產(chǎn)物的鑒定

CCV RT－PCR和CPV PCR反應產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后，送寶生物工程（大連）有限公司進行測序。結果與GenBank發(fā)表的基因序列同源性均在99%以上。

2.4 CCV和CPV雙重PCR擴增結果及產(chǎn)物鑒定

經(jīng)對PCR反應過程中的退火溫度、延伸時間、循環(huán)次數(shù)等條件的優(yōu)化，確定最佳反應條件，確定反應體系為：10×PCR buffer 2.5μL、dNTP 2.5μL、CCV和CPV上下游引物各0.25μL、Taq酶0.5 μL、反轉錄產(chǎn)物的cDNA模板為3.5μL、提取法國疫苗毒的核酸模板1.5μL，去離子水補足25μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃ 預變性3min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。反應產(chǎn)物電泳結果如圖3。雙重PCR產(chǎn)物電泳后，經(jīng)膠回收純化試劑盒純化送至寶生物工程（大連）有限公司測序，擴增的2個條帶測序結果分別與Gen－Bank上CPV和CCV同源性分別為99.3%和99.4%。

圖3 雙重PCR擴增結果Fig.3 The results of duplex PCR

2.5 特異性試驗結果

提取美國、法國、吉林疫苗毒和CCV細胞毒的核酸，用CPV和CCV特異性引物進行擴增，結果表明均只擴增出CPV和CCV特異性條帶，未出現(xiàn)其他條帶（圖4）。

圖4 雙重PCR特異性試驗結果Fig.4 The specificity test results of double PCR

2.6 敏感性試驗結果

提取吉林疫苗和CCV細胞毒核酸、吉林疫苗和CCV細胞毒混合核酸，用分光光度計測定提取的質(zhì)量濃度為分別為2 160ng/μL和6 400ng/μL，取5 μL核酸加入到45μL蒸餾水中，再從中取出5μL進行倍比稀釋，依次為00、10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6，分別進行 PCR 和 RT－PCR。結果兩種方法的敏感性均可達檢測104的稀釋度，分別相當于1.08ng和3.2ng總核酸量（圖5、圖6）。

圖5 CPV敏感性試驗結果Fig.5 The results sensitivity assay of CPV

圖6 CCV敏感性試驗結果Fig.6 The sensitivity assay results of CCV

2.7 雙重PCR的初步應用及比對試驗

96份臨床病例糞便樣品采用膠體金試紙條和雙重PCR擴增方法同時進行檢測（表1）。結果表明，建立的CPV和CCV雙重PCR方法與商品化CPV和CCV抗原檢測試紙條檢測結果完全符合。且其中6份CPV陽性樣品中同時擴增出了CCV，經(jīng)測序與發(fā)表的CCV基因序列同源性為99.2%，表明該樣品為兩種病毒混合感染。同時也說明，在96份樣品中，采用雙重PCR方法CCV檢出24/96，較試紙條方法的18/96檢出率提高了7%。

表1 雙重PCR與膠體金試紙條方法比對試驗結果Table 1 The comparative detection of CPV and CCV in clinical samples using duplex PCRand colloidal glod strip

3 討論

CPV和CCV是犬的兩種急性傳染病，均能引起急性出血性腸炎，在臨床上二者很難鑒別診斷。本試驗在CPV和CCV單項PCR基礎上，通過對反應條件的優(yōu)化建立了CPV和CCV雙重PCR鑒別檢測方法。敏感性試驗表明，可以擴增1ng～10ng的總核酸量。用設計的CPV和CCV引物只能特異性擴增CPV和CCV，不能擴增犬瘟熱病毒、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬鉤端螺旋體和犬黃膽出血群和正常的MDCK細胞，表明建立的方法具有很高的特異性。

用本試驗建立的雙重PCR方法檢測了臨床96份犬糞便樣品，檢測結果為CPV陽性78份，CCV陽性18份，這與膠體金試紙檢測結果完全符合。且其中6份CPV陽性樣品中同時擴增出CCV，經(jīng)測序與發(fā)表的CCV基因序列同源性為99.2%。說明該6份樣品為兩種病毒混合感染。用建立的雙重PCR方法即可用于CPV和CCV的檢測和鑒別診斷，又可用于兩種病毒的混合感染檢測。在一個PCR反應體系中同時快速、準確地鑒定和區(qū)分CPV和CCV，提高了檢測效率，同時又可將兩者鑒別，具有很好的臨床應用價值。該試驗引入了磁珠法應用全自動核酸提取系統(tǒng)提取核酸，避免了以往病毒核酸的DNA和RNA分開提取的繁瑣程序，更加適合大量的臨床樣品的檢測。

［1］ Park J H，Song J Y.Restriction endonuclease analysis of canine parvorirus DNA isolated in Korea［J］Vet Res，1992，32（4）：597－603.

［2］ 殷 震，劉景華.動物病毒學［M］.2版.北京：科學出版社，1997：204－437.

［3］ 蔡寶祥，殷 震，謝三星，等.動物傳染病診斷學［M］.江蘇南京：江蘇科學技術出版社，1993：489－493.

［4］ 夏咸柱.養(yǎng)犬大全［M］.吉林長春：吉林人民出版社，1993：549－553，561－564.

［5］ Wright N G，Cornwell H J，Thompson H J，et al.Canine distemper：current concepts in laboratory and clinical diagnosis［J］Vet Res，1974，94：86－92.

［6］ Hirohito O，Osamu T，Takuya H，et al.Multiplex PCR and multiplex RT－PCR for inclusive detection of major swine DNA and RNA viruses in pigs with multiple infections［J］.J Virol Methods，2009，160：210－214.

［7］ 曹洪志，顏其貴，郭萬柱，等.多重PCR技術在動物疫病診斷中的應用［J］.中國動物檢疫，2007，24（1）：45－47.

［8］ Lee C S，Moon H J，Yang J S，et a1.Multiplex PCR for the simultaneous detection of pseudorabies virus，porcine cytomegalovirus，and porcine eircovirus in pigs［J］.Virol Methods，2007（1）：39－43.

Establishment and Application of Duplex PCR for CPV and CCV Detection

LIN Ying1，GENG Qing－h(huán)ua1，F(xiàn)U Hai－h(huán)ua1，LI Jun－h(huán)uan1，YAN Ming－mei2，LI Cheng－yong1，LIN Shu－ming1

（1.ShenyangExit－importInspectionandQurantinBureau，Shenyang，Liaonig，110016，China；
2.LiaoningAnimalDiseasesPreventionandControlCenter，Shenyang，Liaonig，110016，China）

One pair of PCR primer were designed according to sequence of Canine parvovirus（CPV）and Canine coronavirus（CCV）from GenBank respectively，which could amplify 337bp fragment for CPV and 852bp fragment for CCV.The products of PCR were proved to be specific.The sensitivity of PCR of CPV and CCV showed that the method could amplify 1.08ng and 3.2ng nucleic acid.The result of rudimentary application showed that the method was specific，sensitive，efficient，rapid，and was a new detecting method for the mixed infection of CPV and CCV，which also can differentiate CPV and CCV.

Canine parvovirus；Canine coronavirus；duplex PCR

S852.659.2；S852.659.6

A

1007－5038（2011）10－0071－04

2011－04－20

林 穎（1962－），女，遼寧沈陽人，高級獸醫(yī)師，碩士研究生，主要從事預防獸醫(yī)學研究。