董海影 興桂華 張曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

抑郁癥是一種包括多種精神癥狀和軀體癥狀的復(fù)雜的情感性精神障礙，其發(fā)病率和自殺率高，危害性大〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，大腦增齡性變化是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的最初級階段變化〔2〕。因此，對于大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)增齡性變化的研究可以作為多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究基礎(chǔ)，為防治神經(jīng)退行性疾病提供新的思路。本實(shí)驗(yàn)從行為學(xué)和生化兩個(gè)方面對不同年齡組大鼠抑郁癥動物模型進(jìn)行評價(jià)，旨在分析年齡的增長與抑郁癥發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，為探討抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和防治抑郁癥提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 SD雄性大鼠60只:幼年(4～5周齡)組20只，體重90～110 g;成年(4～5個(gè)月齡)組20只，體重360～380 g;中年(14～15個(gè)月齡)組20只，體重600～620 g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號:SCXK(京)2007-0001。單胺氧化酶(MAO)測定試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)酮/腎上腺酮(CORT)試劑盒(ADL，美國)。

1.2 方法

1.2.1 分組 大鼠在自然晝夜節(jié)律光照、室溫18℃ ～20℃、無噪音環(huán)境下，適應(yīng)性生活1 w后稱重，開野法(Open-Field)評分，每個(gè)年齡組隨機(jī)分為對照組和模型組各10只。

1.2.2 造模 模型組單籠飼養(yǎng)，進(jìn)行21 d慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激刺激(chronic mild unpredictable stress，CMUS)〔1，2〕:電擊足底(電流強(qiáng)度 1 mA，電壓 45 mV，10s/次，間隔 1 min，共 30次)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、搖晃(1 次/s，15 min)、夾尾(3 min)、熱應(yīng)激(45℃，5 min)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、晝夜顛倒、束縛(8 h)、傾斜鼠籠與潮濕墊料(100 g墊料中加入200 ml水)。每日給予1種刺激，順序隨機(jī)。

1.2.3 Open-Field 評分實(shí)驗(yàn)裝置為高40 cm、底邊長80 cm、周壁涂黑、底板為白色的無蓋方箱，底板用黑線劃成16 cm×16 cm的25個(gè)方格。實(shí)驗(yàn)在安靜環(huán)境下進(jìn)行，將大鼠輕放于方箱底板中心，每只動物單獨(dú)測定，每次測定時(shí)間為3 min，兩只動物之間用體積分?jǐn)?shù)為10%的酒精清洗方箱周壁及底板，以免上次動物余留的異味影響下次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)分方法:以大鼠穿越底面格數(shù)為水平活動得分，大鼠4只腳均在同一格子內(nèi)為一格，穿越一格計(jì)1分，如大鼠沿線行走，以每10 cm為1分;以大鼠直立次數(shù)為垂直活動得分，雙足離開底面為標(biāo)志。兩項(xiàng)之和為敞箱實(shí)驗(yàn)總得分。

1.2.4 糖水消耗量實(shí)驗(yàn) 造模前，大鼠進(jìn)行1%蔗糖水?dāng)z取訓(xùn)練，即每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶，第一個(gè)24 h，2瓶均裝有1%蔗糖水;隨后的24 h，1個(gè)瓶裝有1%蔗糖水，1個(gè)瓶裝純凈水。1%蔗糖水消耗量:24 h禁食禁水后，測定1 h動物飲用1%蔗糖水和純水的量，以攝入溶液的量(mg)/動物體重(g)和糖水偏愛(糖水偏愛=糖水消耗/總液體消耗×100%)進(jìn)行評定。

1.2.5 指標(biāo)檢測

1.2.5.1 CRH、ACTH、CORT含量測定 行為學(xué)測試后，經(jīng)大鼠眼靜脈采血，靜置4 h，4℃離心分離血清(1 500 r/min，10 min)，采用ELISA試劑盒測定各激素含量。

1.2.5.2 MAO活性的測定 斷頭處死大鼠，冰上分離出海馬，按照重量和體積比1∶9的比例，加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰浴中制成10%的組織勻漿，4℃離心分離上清(3 500 r/min，10 min)，按試劑盒說明測定MAO活性，同時(shí)測定組織蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 年齡對抑郁癥模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響 見表1。

2.2 年齡對抑郁癥模型大鼠生化指標(biāo)的影響 見表2。

表1 各組大鼠應(yīng)激前后Open-Field行為測定和液體消耗實(shí)驗(yàn)比較(x ± s，n=10)

表2 各組大鼠海馬區(qū)MAO活性和血清CRH、ACTH、CORT含量的比較(x±s)

3 討論

3.1 抑郁癥模型行為學(xué)指標(biāo)評價(jià) CMUS抑郁癥模型理論依據(jù)與人類抑郁癥中慢性、低水平的應(yīng)激源導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生并加速抑郁癥發(fā)展的機(jī)制更接近，CMUS引起的行為改變能夠持續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月被觀察到，且經(jīng)典的抗抑郁治療對之有效，故作為抑郁模型具有較高的價(jià)值，常用于抑郁癥病理生理機(jī)制的研究及抗抑郁藥物的篩選〔3〕。CMUS抑郁癥模型模擬了抑郁癥的核心癥狀——快感缺乏以及社會活動能力和探索行為能力下降等癥狀。糖水消耗實(shí)驗(yàn)和敞箱實(shí)驗(yàn)是檢測模型成功與否的有效客觀指標(biāo)。糖水消耗量反映動物的獎(jiǎng)賞反應(yīng)程度，水平活動反映動物的活動度，垂直活動反映大鼠探究行為和好奇程度。本實(shí)驗(yàn)采用CMUS和孤養(yǎng)兩種經(jīng)典模型結(jié)合的造模方式，利用孤養(yǎng)模擬人類失去社會和家庭支持的孤獨(dú)狀態(tài)，長期輕度不可預(yù)見應(yīng)激模擬抑郁癥發(fā)病的壓力源，造成孤養(yǎng)動物的抑郁狀態(tài)。模型組動物經(jīng)21 d慢性綜合應(yīng)激后水平穿越格數(shù)減少，直立次數(shù)減少，糖水消耗量和糖水偏愛度降低，表現(xiàn)出抑郁癥患者具有的精神運(yùn)動遲滯、興趣喪失、快感缺乏的特征。三個(gè)年齡段的大鼠模型組比較，隨著年齡的增長，抑郁癥模型大鼠的行為學(xué)指標(biāo)變化更加顯著。

3.2 抑郁癥模型生化指標(biāo)評價(jià) Schildkraut和Bunney提出的中樞5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT)和去甲腎上腺素能(noradrenaline，NE)低下假說是抑郁癥發(fā)病機(jī)制的經(jīng)典學(xué)說。MAO是5-HT和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的主要代謝酶，MAO活性升高會導(dǎo)致突觸間隙二者含量的降低，引起抑郁〔4〕。并且經(jīng)過多方研究證明〔5～7〕，抑郁癥時(shí)下丘腦-垂體-腎上腺軸 (hy-Pothalamus-pitutary-adrenal gland，HPA)功能亢進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)中模型組較對照組MAO活性均升高，CRH、ACTH、CORT含量均升高，中年模型組較其余兩個(gè)模型組 MAO活性均升高，CRH、ACTH、CORT含量均升高，說明相同刺激強(qiáng)度下，隨著年齡的增長，抑郁癥模型大鼠的生化指標(biāo)變化亦更加明顯。

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