高艷斌 盧英強 宣兆艷 (長春市公安司法鑒定中心，吉林 長春 3022)

過敏性休克死者類胰蛋白酶和嗜酸性粒細胞趨化因子的免疫組化染色觀察

高艷斌 盧英強1宣兆艷1(長春市公安司法鑒定中心，吉林 長春 130122)

目的 觀察過敏性休克死者各器官組織中肥大細胞類胰蛋白酶(MCT)和嗜酸性粒細胞趨化因子變化，探討過敏性休克死亡法醫(yī)鑒定的形態(tài)學(xué)依據(jù)。方法 機械性損傷死者8例(對照組)，明確診斷為過敏性休克死亡者27例的尸體，取其肺、心、肝、脾、腎、小腸和咽喉組織，石蠟切片，HE染色及免疫組化染色和甲苯胺藍染色。結(jié)果 過敏性休克組肺、小腸、腎MCT增多，肺、小腸肥大細胞增多(P＜0.01)，小腸嗜酸性粒細胞趨化因子增多(P＜0.01)%結(jié)論 過敏性休克死亡的尸體，其肺、小腸、腎MCT增多，肺、小腸肥大細胞增多，小腸嗜酸性粒細胞趨化因子增多。

法醫(yī)病理學(xué);過敏性休克;肥大細胞類胰蛋白酶(MCT);嗜酸性粒細胞趨化因子;免疫組化

過敏性休克是臨床常見的急癥之一，其發(fā)病突然，難以預(yù)見，危及生命，尤其是藥物過敏性休克，常常是導(dǎo)致醫(yī)療糾紛和非法行醫(yī)致死的一個重要原因。其尸檢無特異性病理改變，常常使一些醫(yī)療糾紛和非法行醫(yī)案件久拖不決。本研究通過對類胰蛋白酶(MCT)!嗜酸性粒細胞趨化因子的免疫組化染色研究，旨在從法醫(yī)病理學(xué)角度為過敏性休克死亡的法醫(yī)鑒定提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 27例研究材料取自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)教研室尸檢標(biāo)本，法醫(yī)病理及臨床經(jīng)過均符合過敏性休克。死者年齡0～72歲，平均(34.0±20.8)歲。8例機械性損傷的尸檢標(biāo)本作為對照，材料取自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)教研室。所用兔抗人MCT單克隆抗體及S-P超敏法試劑盒、DAB顯色液均購自福州邁新生物技術(shù)公司。Eotaxin單克隆抗體購自武漢博士德公司。

1.2 方法 取經(jīng)10%甲醛固定的咽喉、肺、心、脾、肝、腎及小腸等組織，經(jīng)石蠟包埋、切片后進行HE染色和超敏SP法免疫組化染色，操作步驟按試劑盒說明書進行。試劑盒中隨帶的照片為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 組間比較采用t和χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 病理診斷過敏性休克死亡的肺組織明顯淤血、間質(zhì)水腫，肺泡擴張、間隔斷裂形成肺氣腫;肺泡腔內(nèi)充滿大量粉染的水腫液，肺間質(zhì)水腫，在肺間質(zhì)可見嗜酸性粒細胞浸潤。腸黏膜內(nèi)可見大量嗜酸性粒細胞浸潤，喉頭黏膜嗜酸性粒細胞浸潤;脾臟內(nèi)有少量嗜酸性粒細胞浸潤。其他原因死亡的肺組織、腸黏膜基本正常。

2.2 MCT染色 診斷為過敏性休克致死案例中，肺組織內(nèi)見大量MCT染色陽性顆粒，呈棕黃色，主要位于血管周圍(圖1A);腸黏膜有大量MCT陽性顆粒(圖1B);在其他組織內(nèi)也可見不同程度的MCT陽性顆粒。尤其是在腎遠曲小管和近曲小管，且以遠曲小管為多(圖1C)，MCT陽性顆粒多見。非過敏原因致死的案例中，肺、腸等組織罕見陽性顆粒(圖1D、圖1E)%實驗組與對照組MCT陽性顆粒記數(shù)見表1。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，組間差異具有顯著性(P＜0.01)%

2.3 Eotaxin染色 在過敏性休克致死的案例中，腸黏膜Eotaxin陽性顆粒多見(圖1F)%而其他案例，各臟器罕見eotaxin陽性顆粒。

圖1 過敏性休克死者及非過敏原因死者組織的免疫組化改變(×40)

表1 實驗組與對照組MCT陽性百分率比較

3 討論

過敏性休克屬I型變態(tài)反應(yīng)性疾病，肥大細胞(mast cell，MC)是機體內(nèi)一種重要的免疫細胞，能分泌MCT、組織胺、5-羥色胺、慢反應(yīng)物質(zhì)和肝素等多種生物活性物質(zhì)，與變態(tài)反應(yīng)性疾病有著密切的關(guān)系，在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用。肥大細胞MCT是肥大細胞釋放的一種活性因子，是肥大細胞脫顆粒時隨組胺一起釋放的，但比組胺釋放晚，且持續(xù)時間長，其增多提示有過敏現(xiàn)象出現(xiàn)。

1987年，Schwartz等〔1〕發(fā)現(xiàn)在過敏性休克后，血清和血漿中MCT升高。1989年，Schwartz等〔2〕發(fā)現(xiàn)在過敏性休克后，1～2 h后血清 MCT升高，半衰期為2 h，直到4 d后，仍能檢出MCT。1998年Edston〔3〕通過放免技術(shù)測定了193具尸體血中MCT，發(fā)現(xiàn)將鑒定標(biāo)準定為10 μg/L時，其特異性和準確性最好。但放免有其缺點：試劑盒價格昂貴，且有放射性污染，不適于廣泛應(yīng)用。1999年，Enrique〔4〕采用UniCAPMCT酶聯(lián)免疫熒光法來測定MCT，該法更準確，而且沒有放射性污染。1999年，F(xiàn)ineschi等〔5〕對1例過敏性休克死亡的病人取肺作了免疫組化，發(fā)現(xiàn)肺MCT升高。2010年，王昌亮等〔6〕通過動物實驗發(fā)現(xiàn)過敏豚鼠肺組織中MCT和胃促胰酶的表達明顯增強。

MCT主要通過蛋白酶激活受體2(PAR-2)起作用。PAR-2在心血管、氣道、腸、神經(jīng)等組織中均有表達。MCT是最有效的PAR-2激活劑，能夠裂解許多組織、細胞的PAR-2受體。某些疾病發(fā)生時，PAR-2受體在組織中的表達可有變化。如IgA腎病時，腎近曲小管和腎間質(zhì)PAR-2受體表達增強〔7〕。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過敏性休克致死案例，腎遠曲小管和近曲小管內(nèi)MCT顆粒較多，且遠曲小管內(nèi)為多。因MCT為蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)是在近曲小管重吸收的，故推測遠曲小管PAR-2受體表達增強。

Eotaxin是一種嗜酸性粒細胞選擇性化學(xué)趨化因子，對于其他類型的白細胞作用微弱，這明顯不同于所有其他的趨化因子。Eotaxin也被證實是一種強有力的嗜酸性粒細胞激活劑，能夠誘導(dǎo)過氧化物的產(chǎn)生并釋放蛋白質(zhì)顆粒。給予豚鼠、嚙齒類動物和靈長類動物體內(nèi)注射Eotaxin，嗜酸性粒細胞是唯一聚集的細胞，說明Eotaxin對于嗜酸性粒細胞具有很強的優(yōu)先選擇性，對其他類型白細胞則影響較小。

Eotaxin在體內(nèi)多種正常細胞，如皮膚、支氣管上皮、腸道上皮、胸腺和骨骼肌均有結(jié)構(gòu)性表達。當(dāng)受到各種炎癥刺激后，表達顯著增高。大量的研究表明，支氣管哮喘時，氣道黏膜Eotaxin表達顯著增強，其表達強度與支氣管壁嗜酸性粒細胞數(shù)及與哮喘嚴重度呈顯著正相關(guān)〔8〕。過敏性皮炎時，皮損區(qū)的表皮細胞和皮下炎癥細胞(包括巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和T細胞)中，Eotaxin和MCP 4的mRNA陽性細胞數(shù)顯著增加，其表達水平與病灶內(nèi)嗜酸性粒細胞和巨噬細胞數(shù)相關(guān)〔9〕。

本研究發(fā)現(xiàn)腸黏膜Eotaxin陽性顆粒多見，與HE染色腸黏膜嗜酸性粒細胞較多相符。說明Eotaxin是過敏性休克時嗜酸性粒細胞聚集的主要原因。

1 Schwartz LB，Metcalfe DD，Miller JS，et al.Tryptase levels as an indicator of mast-cell activation in systemic anaphylaxis and mastocytosis〔J〕.N Engl J Med，1987;316(26)：1622-6.

2 Schwartz LB，Yunginger JW，Miller J.Time course of appearance and disappearance of human mast cell tryptase in the circulation after anaphylaxis〔J〕.J Clin Invest，1989;83(5)：1551-5.

3 Edston E，van Hage-Hamsten M.β-tryptase measurements post-mortem in anaphylactic death and in controls〔J〕.For Sci Int，1998;9(3)：135-42.

4 Enrique E，Carcia-Ortega P，Sotorra O，et al.Usefulness of unicap-tryptase fluoroimmunoassay in the diagnosis of anaphylaxis〔J〕.Allergy，1999;54(6)：602-6.

5 Fineschi V，Monasterolo G，Rosi R，et al.Fatal anaphylactic shock during a fluorescein angiography〔J〕.For Sci Int，1999;100(1-2)：137-42.

6 王昌亮，張國華，吳 旭，等.豚鼠過敏休克肺組織中類胰蛋白酶和胃促胰酶的表達〔J〕.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2010;125(4)：236-9.

7 Giuseppe G，Paola P，Giuseppina C，et al.Protease-activated receptor-2 expression in IgA nephropathy：a potential role in the pathogenesis of interstitial fibrosis〔J〕.J Am Soc Nephrol，2003;14：2072-83.

8 Humbles AA，Conroy DM，Marleau S，et al.Kinetics of eotaxin generation and its relationship to eosinophil accumulation in allergic airways disease analysis in a guinea pig model in vivo〔J〕.J Exp Med，1997;186：601-12.

9 Taha RA，Minshall EM，Leung DY，et al.Evidence for increased expression of eotaxin and monocyte chemotactic protein-4 in atopic dermatitis〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2000;105：1002-7.

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A

1005-9202(2011)10-1822-02

1 吉林大學(xué)法醫(yī)學(xué)系

宣兆艷(1964-)，女，副教授，主要從事法醫(yī)病理和法醫(yī)臨床研究。

高艷斌(1976-)，男，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。

〔2010-12-14收稿 2011-03-15修回〕

(編輯 曲 莉)