劉可鑫， 周 翎， 劉攀峰， 張萌萌， 曹 洋， 許 枬*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600;2.大連海港醫(yī)院，遼寧 大連 116012;3.撫順市農(nóng)業(yè)特產(chǎn)學(xué)校，遼寧撫順 113123)

杜仲為杜仲科杜仲屬植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮，是我國名貴滋補藥材［1］，臨床以炮制應(yīng)用為主［2］。杜仲的歷代炮制方法有鹽制、姜制、蜜制等，現(xiàn)以鹽制為主［3］，根據(jù)“入鹽走腎”的炮制理論，認為其鹽制的炮制作用是增強補肝腎，強筋骨的功效［3］。由于杜仲炮制歷來以“斷絲”為度［4］，有人提出切制也可斷絲，沒有必要鹽制的看法，也有人一味追求“斷絲”，甚至將杜仲炮制成杜仲炭(斷絲完全)。顯然“斷絲”的本質(zhì)已經(jīng)成為杜仲鹽制必須解決的重要問題。因此，有必要深入研究杜仲鹽制“斷絲”所引起的化學(xué)變化，為其炮制原理研究奠定基礎(chǔ)。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲在不同的溫度條件下鹽制，化學(xué)成分變化顯著［5］:鹽制后(溫度超過140℃)，杜仲中環(huán)烯醚萜類成分含量顯著減少的同時，炮制品薄層色譜中，在與生品相同的位置上，Rf值約0.6的粉色斑點和Rf值約0.8的黃綠色斑點含量明顯增加。據(jù)此可以說明，鹽制后杜仲中有些化學(xué)成分的含量增加。分析上述情況，我們認為炮制溫度所產(chǎn)生的鹽制杜仲化學(xué)成分的差異可能會造成其療效的迥異。為深入探討鹽制“斷絲”的物質(zhì)基礎(chǔ)，本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)地分離了鹽制后杜仲的增加成分，并結(jié)合色譜分析揭示鹽制前后杜仲化學(xué)成分的變化，為杜仲的鹽制工藝研究和炮制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營廠2022A型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱;核磁共振譜用Burker Avance 600型核磁共振光譜儀;Angilent 1100 series高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);柱層析與薄層層析用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品。

1.2 藥材 杜仲藥材購自北京同仁堂，產(chǎn)地貴州。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室王冰教授鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥樹皮。

2 杜仲炮制后增量成分的分離

2.1 提取與分離 為更好地控制炮制溫度，本實驗取生杜仲絲，以2%鹽水潤透，平鋪在不銹鋼方盤內(nèi)，放入烘箱，60℃烘干。再將上述處理好的杜仲絲在160℃加熱至斷絲，制成鹽制杜仲。

取上述制成的鹽杜仲10 kg，粉碎，用95%乙醇滲漉提取1周，提取液回收乙醇，濃縮，得浸膏1 100 g。取所得浸膏800 g，加水制成混懸液，分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。采用薄層色譜檢查，結(jié)果表明，炮制后的增加成分主要集中在氯仿萃取物中，因此對氯仿萃取物進行分離。取氯仿層浸膏416.8 g，用甲醇溶解，按樣品與硅膠1:1.5的比例，取600 g硅膠拌樣，揮干溶劑待用。以樣品與硅膠1:2.5的比例，濕法裝硅膠柱，硅膠用量為1 000 g。將樣品干法上于硅膠柱頂端，以石油醚-丙酮(100:1，50:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1)為洗脫劑，進行梯度洗脫。每300 mL為一個流分，收集洗脫成分。采用薄層色譜法，將各流份與生杜仲絲、鹽制杜仲進行對照分析，跟蹤檢查炮制后含量增加的成分，發(fā)現(xiàn)石油醚-丙酮(10:1)部分的Fr.7含有炮制后含量增加的黃綠色斑點，采用相同的分析方法確定石油醚-丙酮(10:1)部分的Fr.8含有炮制后含量增加的粉紅色斑點。將Fr.7經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，再經(jīng)Sephadex LH-20柱層析純化，得到化合物1。將Fr.8采用硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(2:1→1:1)進行梯度洗脫，其中石油醚-乙酸乙酯(2:1)洗脫的流份，經(jīng)HPLC制備，得到化合物2和化合物3;石油醚-乙酸乙酯(1:1)洗脫的流份，經(jīng)HPLC制備，得到化合物4和化合物5。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:淡黃色油狀物，三氯化鐵試劑顯鐵紅色，5%香草醛濃硫酸試劑顯灰綠色。1H-NMR(600 MHz，CD3OD-d4)δ:9.51(1H，d，J=7.8 Hz，CHO)，7.50(1H，d，J=15.6 Hz，H-7)，7.10(1H，dd，J=1.8，8.14 Hz，H-6)，7.18(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.81(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，6.60(1H，dd，J=7.8，15.6 Hz，H-8)，3.85(3H，s，OMe)。13C-NMR(150 MHz，CD3OD-d4)δ:126.1(C-1)，110.6(C-2)，150.2(C-3)，148.0(C-4)，125.2(C-5)，123.8(C-6)，154.8(C-7)，115.2(C-8)，194.8(CHO)，55.0(OMe)。上述光譜數(shù)據(jù)與文獻［6］報道的阿魏醛基本一致，故鑒定化合物1為阿魏醛。

化合物2:白色針狀結(jié)晶，5%香草醛濃硫酸試劑顯紫紅色。1H-NMR(600 MHz，CD3OD-d4)δ:6.93(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，6.78(1H，d，J=1.8，8.4 Hz，H-6″)，6.75(1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，3.10(2H，m，H-1，5)，4.67(2H，J=4.2 Hz，d，H-2，6)，4.20(4H，m，H-4，8)，3.83(3H，s，OMe)。13C-NMR(150 MHz，CD3OD-d4)δ:53.9(C-1，5)，71.1(C-4，8)，86.0(C-2，6)，132.3(C-1′，1″)，109.5(C-2′，2″)，147.6(C-3′，3″)，145.8(C-4′，4″)，114.6(C-5′，5″)，118.6(C-6′，6″)，54.9(OMe)。上述光譜數(shù)據(jù)與文獻［7］報道的松脂素數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物2為松脂素。

化合物3:白色針狀結(jié)晶，5%香草醛濃硫酸試劑顯紫紅色。1H-NMR(600 MHz，CD3OD-d4)δ:6.75～6.94(6H，m，arom)，4.40(1H，d，J=7.2 Hz，H-6)，4.84(1H，d，J=6 Hz，H-2)，3.84(3H，s，OMe)。13C-NMR(150 MHz，CD3OD-d4)δ:54.3(C-1)，49.9(C-5)，69.2(C-4)，70.5(C-8)，88.0(C-2)，82.1(C-6)，132.4(C-1′)，129.9(C-1″)，109.4(C-2′)，109.0(C-2″)，147.4(C-3′)，147.7(C-3″)，145.2(C-4′)，146.0(C-4″)，114.6(C-5′，5″)，118.8(C-6′)，119.9(C-6″)，55.0(OMe)。上述光譜數(shù)據(jù)與文獻［8］報道的表松脂素數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物3為表松脂素。

化合物4:白色粉末，5%香草醛濃硫酸試劑顯紫紅色。1H-NMR(600 MHz，CD3OD-d4)δ:3.12 ～3.29(2H，m，H-1，5)，3.84 ～4.25(4H，m，H-4，8)，4.69(2H，d，J=4.2 Hz，H-2，6)，6.64 ～ 6.94(5H，m，arom)，3.83(3H，s，OMe)。13C-NMR(150 MHz，CD3OD-d4)δ:55.3(C-1)，55.5(C-5)，72.6(C-4)，72.7(C-8)，87.4(C-2)，87.6(C-6)，133.1(C-1′)，133.7(C-1″)，104.5(C-2′)，110.9(C-2″)，149.3(C-3′)，149.1(C-3″)，136.2(C-4′)，147.3(C-4″)，149.3(C-5′)，116.0(C-5″)，104.5(C-6′)，120.0(C-6″)，56.4(OMe)，56.7(OMe)。上述光譜數(shù)據(jù)與文獻［9］報道的中脂素數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物4為中脂素。

化合物5:白色粉末5%香草醛濃硫酸試劑顯紫紅色。1H-NMR(600 MHz，CD3OD-d4)δ:3.29(2H，m，H-1，5)，4.12(4H，m，H-4，8)，4.83(1H，d，J=6 Hz，H-2)，4.41(1H，d，J=7.2 Hz，H-6)，6.65 ～ 6.96(5H，m，arom)，3.84(3H，s，OMe)。13C-NMR(150 MHz，CD3OD-d4)δ:55.6(C-1)，55.8(C-5)，70.6(C-4)，70.5(C-8)，83.5(C-2)，83.6(C-6)，131.3(C-1′)，133.8(C-1″)，104.0(C-2′)，110.5(C-2″)，149.2(C-3′)，148.8(C-3″)，134.7(C-4′)，146.6(C-4″)，149.2(C-5′)，116.0(C-5″)，104.0(C-6′)，119.4(C-6″)，56.4(OMe)，56.8(OMe)。上述光譜數(shù)據(jù)與文獻［9］報道(－)-medioresinol數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物5為(－)-medioresinol。

3 杜仲炮制后成分變化研究

3.1 TLC色譜鑒別 由于以前實驗已經(jīng)采用薄層色譜法分析了炮制后含量降低的成分［5］，因此本實驗只分析炮制后含量增加的成分。將分離得到的5個化合物與杜仲160℃鹽制品的供試品點于同一薄層板上，以環(huán)己烷-氯仿-丙酮-甲醇(1:7:2:1.5)為展開劑，展開，噴以5%香草醛硫酸試液，加熱，顯色，結(jié)果見圖1。

圖1 杜仲生品和炮制品的薄層圖譜Fig.1 TLC analysis of Eucommiae Cortex and processed Eucommiae Cortex with salt

由圖1可見，阿魏醛是炮制后含量明顯增加的化學(xué)成分。由于松脂素、表松脂素、中脂素、(－)-medioresinol的結(jié)構(gòu)極其相似，且松脂素與表松脂素、中脂素與(－)-medioresinol分別互為立體異構(gòu)體，所以該4個單體化合物在薄層圖譜中分離度很小，Rf值幾乎相同，不能很好的確認成分變化情況。但根據(jù)其Rf值，基本可以確認所分離的化學(xué)成分中有炮制后含量增加的成分。

3.2 HPLC分析 色譜條件:色譜柱Kromasil-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);以乙腈為流動相 A，以0.1%磷酸水為流動相B，梯度洗脫(0 min 8:92;10 min 15: 95;25 min，15: 85;35 min，17:83;50 min，23:77;70 min，33:67)。流速:1.0 mL/min;檢測波長:230 nm;進樣量:10 μL。柱溫:25 ℃。

供試品溶液的制備:取生杜仲絲及160℃制備鹽杜仲粉末各1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲40 min。冷卻后稱定重量，補足減失的重量。濾過，精密移取50 mL置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇使溶解，定容至5 mL量瓶中，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

對照品溶液的制備:取阿魏醛，松脂素，表松脂素，中脂素，(－)-medioresinol，京尼平苷酸，綠原酸，松脂醇二葡萄糖苷，中脂素二葡萄糖苷，丁香脂素二葡萄糖苷各5 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解，并定容至刻度，搖勻，即得。

生品與炮制品的HPLC指紋圖譜分析:采用上述色譜條件，建立杜仲生品和鹽制品(160℃)HPLC指紋圖譜，以分離得到的阿魏醛，松脂素，表松脂素，中脂素，(－)-medioresinol以及前期研究分離得到的京尼平苷酸，綠原酸，松脂醇二葡萄糖苷，中脂素二葡萄糖苷，丁香脂素二葡萄糖苷為對照品，對杜仲生品和炮制品的HPLC指紋圖譜的色譜峰進行標(biāo)定。結(jié)果見圖2。

圖2 杜仲生品、炮制品HPLC指紋圖譜比較Fig.2 Comparative fingerprint of Eucommiae Cortex and processed Eucommiae Cortex with salt

由圖2可見，與(－)-medioresinol，中脂素，松脂素，表松脂素和阿魏醛分別對應(yīng)的 19，20，21，22，23號峰均有所增高，與京尼平苷酸，綠原酸，松脂醇二葡萄糖苷，中脂素二葡萄糖苷，丁香脂素二葡萄糖苷所對應(yīng)的1，3，8，9，10號峰均有所減低，具體峰面積值變化見表1。

表1 杜仲鹽制前后成分色譜峰的保留時間和峰面積Table 1 Retention time and peak area of substances’peaks of Eucommiae Cortex and processed Eucommiae Cortex with salt

由表1可見，不同化學(xué)成分鹽制前后色譜峰面積變化較大，其中京尼平苷酸、綠原酸、松脂素二葡萄糖苷、中脂素二葡萄糖苷、丁香脂醇二葡萄糖苷的色譜峰面積鹽制后降低，而(－)-medioresinol、中脂素、松脂素、表松脂素、阿魏醛的色譜峰面積鹽制后則升高。

4 討論

經(jīng)柱色譜分離，從鹽制杜仲中得到阿魏醛、(－)-medioresinol、中脂素、松脂素、表松脂素等5個杜仲炮制后含量增加的化學(xué)成分。根據(jù)薄層色譜以及HPLC色譜分析，證實所分離得到的5個化合物確為杜仲鹽制后含量增加的成分，其中4個成分為木脂素類的苷元，1個成分為簡單苯丙素類成分。由此說明鹽制溫度對杜仲中的木脂素類成分影響顯著。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，杜仲鹽制后環(huán)烯醚萜類成分含量減少［5］;本研究又發(fā)現(xiàn)，炮制后杜仲中木脂素類成分的苷元含量增加，說明鹽制過程不僅對杜仲中環(huán)烯醚萜類化學(xué)成分的影響較大，對木脂素類成分的影響也十分顯著。因此杜仲鹽制工藝研究中要十分注重控制炮制溫度。

化學(xué)成分是功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，又是性味、歸經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此要深入揭示杜仲的炮制原理和炮制作用，需要在化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，對鹽制杜仲藥效作用的機理進行深入探討，結(jié)合化學(xué)成分和功效的差異及二者的相關(guān)性來闡釋杜仲的炮制原理，為杜仲的炮制工藝研究和炮制品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

以往的研究報道［10］，杜仲中含有大量的木脂素二葡萄糖苷，如中脂素二葡萄糖苷，松脂醇二葡萄糖苷，丁香脂素二葡萄糖苷……，杜仲炮制后木脂素類成分的苷元顯著增加，可能是由于在炮制過程中，木脂素二葡萄糖苷的糖苷鍵斷裂，使木脂素二葡萄糖苷降解成相應(yīng)的苷元所致。

TLC雖然具有操作簡單，分析速度快，不同顯色劑可以協(xié)助識別化學(xué)成分的優(yōu)點，但由于其分離效率相對較低，有些結(jié)構(gòu)相近或極性相似的化學(xué)成分在薄層色譜中分離效果不理想，因此炮制前后化學(xué)成分變化研究應(yīng)采用多種色譜結(jié)合，綜合分析，揭示炮制前后化學(xué)成分變化情況。另外，本實驗采用杜仲生品和160℃鹽制品的對比分析考察炮制前后成分含量變化，雖然不能全面反應(yīng)溫度對成分變化的影響，但結(jié)合薄層分析和HPLC分析，依然可以確認炮制溫度對杜仲化學(xué)成分的影響非常顯著。

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