黃興富， 黎其萬(wàn)， 劉宏程， 王繼良， 孫浩巖， 邵金良

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，云南 昆明 650223;2.昆明醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，云南 昆明 650031)

苦蕎麥Fagopyrum tataricum又名韃靼蕎麥，是適于在寒冷氣候下生長(zhǎng)的寥科蕎麥屬一年生草本雙子葉植物，其根、莖、葉、花、種子及籽殼中都含有大量黃酮類化合物，主要成分有槲皮素、山柰酚和蘆丁等［1］。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)都證實(shí)苦蕎具有降血糖、降血脂、降尿糖、防便秘等功效［2-3］。被權(quán)威專家稱為“三降食品”和“21世紀(jì)人類的健康食品”。此外，苦蕎中蛋白質(zhì)含量也較高，有極高的營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)藥價(jià)值［4］。蕎麥蛋白除能顯著降低血液膽固醇濃度，其效果優(yōu)于大豆蛋白質(zhì)［5］，還具有抗衰老、抑制大腸癌的發(fā)生等作用。目前國(guó)內(nèi)對(duì)植物中的黃酮類化合物的測(cè)定主要有比色法，紫外分光光度法和HPLC法［6］，但比色法的干擾因素較多，而紫外分光光度法準(zhǔn)確度不高。近年來(lái)國(guó)內(nèi)有采用高效液相色譜法測(cè)定苦蕎黃酮中蘆丁、金絲桃苷、牡荊苷、槲皮素等黃酮化合物的含量［7-8］，但尚未見文獻(xiàn)報(bào)道同時(shí)測(cè)定蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量。本試驗(yàn)建立了用高效液相色譜同時(shí)測(cè)定苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚含量的方法，并對(duì)用90%甲醇索氏提取物蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 戴安Summit高效液相色譜儀;電子分析天平(德國(guó)賽多利斯CP-224S，0.1 mg/100 g)。

1.2 試藥 蘆丁(含量≥98%，批號(hào):100080-200707)、槲皮素(含量≥98%，批號(hào):100081-200406)和山柰酚(含量≥98%，批號(hào):0861-200002)對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;17種不同品種的蕎麥(云南省農(nóng)科院生物與種資資源研究所提供);乙腈為色譜純(Tedia，美國(guó))，流動(dòng)相用水為去離子水經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾;甲醇和磷酸均為分析純。

2 溶液的配制

2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品蘆丁10 mg、槲皮素1 mg和山柰酚1 mg，于10 mL量瓶中，用甲醇定容，配成濃度分別為1，0.1和0.1 mg/mL的對(duì)照品貯備液。

2.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取樣品 10.0 g，用90%甲醇索氏提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，于100 mL量瓶中，加甲醇定容，取1 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。

3 色譜條件

色譜柱:Diamonsil-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm);流動(dòng)相組成:乙腈-0.2%磷酸溶液線性梯度洗脫，洗脫程序見表1;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):365 nm;進(jìn)樣量:20 μL。色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 混合對(duì)照品(A)、樣品(B)的色譜圖

4 方法與結(jié)果

4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取蘆丁、槲皮素和山柰酚對(duì)照品貯備液 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL;0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL;0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mL，于 10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成系列濃度的對(duì)照品混合溶液，取20 μL進(jìn)樣后記錄峰面識(shí)，以峰面積Y對(duì)對(duì)照品濃度X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到蘆丁、槲皮素和山柰酚的回歸方程分別為:

蘆丁、槲皮素和山柰酚的線性范圍分別為:40～200 μg/mL、2 ～16 μg/mL、1 ～12 μg/mL。液相色譜的信噪比 S/N=3。蘆丁、槲皮素和山柰酚的最低檢測(cè)限分別為0.03 μg/mL、0.009 μg/mL、0.005 μg/mL。

4.2 精密度試驗(yàn) 精密稱取6份樣品(西苦6-14)10.0 g，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算蘆丁、槲皮素和山柰酚的RSD分別為0.84%、0.57%、1.27%。

4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取蘆丁、槲皮素和山柰酚的對(duì)照品溶液，配成濃度分別為120、8、4 μg/mL在室溫下放置，分別在 0、2、4、8、12、24 h 時(shí)測(cè)定，計(jì)算得蘆丁、槲皮素和山柰酚峰面積RSD分別為0.78%、0.83%、1.34%。表明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取樣品(西苦6-14)6份，按2.2項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，測(cè)得樣品中蘆丁、槲皮素和山柰酚含量的RSD分別為0.77%、0.51%和1.18%。

4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品(西苦6-14)11份，每份約10.0 g，樣品按2.2項(xiàng)處理。1份是空白，其余10份分為2組，分別精密加入約相當(dāng)于樣品中蘆丁、槲皮素和山柰酚含量80%、120%的對(duì)照品(各5個(gè))，按供試品溶液制備和測(cè)定方法操作，計(jì)算蘆丁、槲皮素和山柰酚的平均回收率分別為:97.86%、99.02%、97.85%。見表2。

4.6 樣品含量測(cè)定 分別精密稱取每個(gè)品種的苦蕎3份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件和測(cè)定方法，測(cè)定峰面積，外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果每個(gè)品種的苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量分別見表3。

5 討論

5.1 波長(zhǎng)的選擇 本試驗(yàn)考擦了260 nm和365 nm不同吸收波長(zhǎng)的圖譜，發(fā)現(xiàn)蘆丁、槲皮素和山柰酚的最大吸收波長(zhǎng)不一，在365 nm波長(zhǎng)下槲皮素和山柰酚有最大吸收，而蘆丁也有較好的吸收，且干擾少，圖譜特征性強(qiáng)。故選擇365 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

5.2 流動(dòng)相的選擇 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾試過(guò)甲醇-水，乙腈-水溶液等為流動(dòng)相，分離效果均不理想，色譜峰拖尾嚴(yán)重，而采用乙腈-0.2%磷酸水溶液后分離效果有明顯的改善，且峰形均較好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，故最后選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相。

5.3 提取方法的選擇 對(duì)苦蕎的提取方法做了下列考察(溶劑為甲醇和乙醇):索氏提取法、浸漬法、回流提取法、超聲波提取法，發(fā)現(xiàn)用索氏提取法，溶劑為甲醇的效果最好。又對(duì)60%、80%、90%和100%的甲醇做了考擦，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90%的甲醇提取的黃酮是最多的，尤其是山柰酚。

表2加樣回收率試驗(yàn)(n=5)

表3 不同來(lái)源苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量(n=3)

5.4 樣品測(cè)定結(jié)果分析 從測(cè)定結(jié)果看，10個(gè)不同來(lái)源苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量存在較大的差異:云蕎53中蘆丁的含量最高，KQ08-10中蘆丁的含量最少;KQ08-10中槲皮素的含量最高，四川西昌苦3-7中槲皮素的含量最少;KQ08-06中山柰酚的含量最高，四川梁山苦和云蕎63中都沒檢測(cè)到山柰酚。

這為尋找苦蕎同時(shí)具有高含量蘆丁、槲皮素和山柰酚等黃酮化合物提供了可能，為以后品質(zhì)性狀的選擇或雜交選育提供了依據(jù)。

5.5 小結(jié) 本試驗(yàn)采用 HPLC法同時(shí)測(cè)定苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚3種成分的含量，方法簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于苦蕎的質(zhì)量控制。

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