劉 晉，郭長(zhǎng)江，吳健全，楊繼軍，韋京豫，高蔚娜

(1.衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050;2.總后軍需裝備研究所，北京 100010)

高原地區(qū)低壓、低氧、寒冷等特殊環(huán)境因素對(duì)機(jī)體生理功能、營(yíng)養(yǎng)代謝等均產(chǎn)生十分顯著的影響，初入高原后，主要癥狀有頭痛、惡心、食欲減退、消化吸收功能下降等。一些研究表明，補(bǔ)充水溶性維生素可以提高機(jī)體的耐缺氧能力，補(bǔ)充大劑量煙酰胺或以水溶性維生素為主的復(fù)合維生素可以提高動(dòng)物的急性耐缺氧能力;補(bǔ)充3倍于正常需要量的維生素B1、B2、PP能有效改善動(dòng)物的能量代謝。我們前期的研究證明補(bǔ)充含有大劑量B族維生素的復(fù)合營(yíng)養(yǎng)制劑可以有效提高小鼠急性密閉缺氧生存時(shí)間[1]，并提高初入高原青年的血氧飽和度及改善心肺功能[2]。維生素提高機(jī)體耐缺氧能力的確切作用機(jī)制目前還不是十分清楚，理論而言，低氧暴露者通過合理補(bǔ)充維生素，可以達(dá)到預(yù)防營(yíng)養(yǎng)缺乏病，改善營(yíng)養(yǎng)狀況的目的，從而間接提高機(jī)體耐缺氧能力，但是，有關(guān)研究結(jié)果顯示，這些維生素還可通過其他途徑發(fā)揮抗缺氧的作用。本文在上述研究基礎(chǔ)上，圍繞與能量代謝相關(guān)的三種主要水溶性維生素---維生素B1、B2、PP，探討了急性低氧導(dǎo)致的三大營(yíng)養(yǎng)素物質(zhì)代謝的改變及聯(lián)合補(bǔ)充維生素B1、B2和PP對(duì)這種改變的改善作用及對(duì)能量代謝產(chǎn)生的影響，從而初步揭示聯(lián)合補(bǔ)充這三種維生素提高機(jī)體耐缺氧能力作用的代謝機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

雄性昆明小鼠50只(體重14～16 g)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度30%～40%，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺氧對(duì)照組、2倍、4倍 、8 倍維生素 B1、B2、PP 補(bǔ)充組 ，每組 10只 。正常對(duì)照組和低氧對(duì)照組采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，基礎(chǔ)飼料按照美國(guó)AIN-93成年嚙齒類動(dòng)物飼料配方配制[3](每千克基礎(chǔ)飼料中含維生素B1、B2、PP分別為5 mg，6 mg，30mg)，三個(gè)劑量補(bǔ)充組飼料是在基礎(chǔ)飼料中聯(lián)合補(bǔ)充維生素B1、B2和PP，使其含量分別提高至基礎(chǔ)飼料的2倍、4倍和8倍。各組動(dòng)物以相應(yīng)飼料喂養(yǎng)2周，自由攝食及飲水。

1.2 低氧暴露方法

各組動(dòng)物以相應(yīng)飼料喂養(yǎng)2周后，正常組仍在常壓動(dòng)物房飼養(yǎng)，低氧組動(dòng)物進(jìn)入低壓氧艙進(jìn)行模擬高度為6000m的暴露，過程如下:以1000m/min的速度由海平面高度上升至5000m，停留3 min;再以500m/min速度上升至6000m，停留8 h;此后再以500m/min速度下降至5000m，停留 3 min，再以1000m/min的速度下降至海平面高度[4]。眼眶后靜脈叢采血，取1 ml全血抗凝后用于ATP含量測(cè)定，剩余血液離心取血清，同時(shí)迅速剝離肝臟組織于冷凝管中，全血、血清及肝臟組織均迅速置于-20℃冰箱保存。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

血清血糖、乳酸、丙酮酸、游離脂肪酸采用化學(xué)比色法測(cè)定，均使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。肝糖原測(cè)定采用蒽酮法，血清尿素氮測(cè)定采用二乙酰-肟法。血清β-羥丁酸采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定，USCN LIFE SCIENCE&TECHNOLOGY公司提供試劑盒。全血ATP含量測(cè)定采用化學(xué)發(fā)光法，使用北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司出品的試劑盒。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物碳水化合物相關(guān)代謝物變化

與正常對(duì)照組相比，低氧組中血清葡萄糖、乳酸、丙酮酸和肝糖原水平均顯著升高，補(bǔ)充2倍維生素后，除乳酸外，其它三個(gè)指標(biāo)與正常對(duì)照組比仍顯著升高;4倍和8倍維生素補(bǔ)充組，除丙酮酸外的三個(gè)指標(biāo)均降低至與正常對(duì)照組比無(wú)顯著性差異的水平(表1)。

Tab.1 Changes of serum glucose，lactic acid，pyruvate and liver glycogen contents in mice exposed to acute hypoxia(，n=10)

Tab.1 Changes of serum glucose，lactic acid，pyruvate and liver glycogen contents in mice exposed to acute hypoxia(，n=10)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal

Normal 9.53±2.64 8.10±3.23 0.40±0.03 1.21±0.47 Hypoxia 12.42±1.84* 11.68±2.39* 0.56±0.06** 2.10±0.68*2 times 12.02±2.07* 9.79±2.68 0.54±0.08** 2.15±0.76*4 times 10.17±3.16 10.27±2.97 0.51±0.07* 1.80±0.478 times 11.66±2.08 10.13±2.19 0.48±0.11* 1.87±0.73

2.2 各組動(dòng)物蛋白質(zhì)及脂類相關(guān)代謝物變化

低氧暴露后，反映蛋白質(zhì)分解水平的血清尿素氮及脂肪動(dòng)員情況的血清游離脂肪酸和β-羥丁酸水平均顯著升高，補(bǔ)充2倍維生素后有降低的趨勢(shì)，但尿素氮和血清游離脂肪酸與正常對(duì)照組比仍顯著升高，4倍和8倍維生素補(bǔ)充組中，三個(gè)指標(biāo)均繼續(xù)呈現(xiàn)不同程度降低的趨勢(shì)(表2)。

2.3 各組動(dòng)物全血ATP含量結(jié)果

全血ATP含量低氧后降低，補(bǔ)充2倍、4倍、8倍維生素B1、B2、PP后呈不同程度的升高趨勢(shì)，其中8倍補(bǔ)充組效果最好(圖1)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。各組全血ATP含量分別是:正常對(duì)照組為(1.31±0.54)mmol/mg Hb，低氧對(duì)照組(0.96±0.27)mmol/mg Hb，2倍組(1.08±0.25)mmol/mg Hb，4倍組(1.06±0.31)mmol/mg Hb，8倍組(1.21±0.18)mmol/mg Hb。

Tab.2 Changes of serum urea nitrogen，free fatty acids and β-hydroxybutyric acid contents in mice exposed to acute hypoxia(，n=10)

Tab.2 Changes of serum urea nitrogen，free fatty acids and β-hydroxybutyric acid contents in mice exposed to acute hypoxia(，n=10)

*P＜0.05 vs normal

Group Urea nitrogen(mmol/L)Free fatty acids(μmol/L)β-hydroxybutyric acid(nmol/L)Normal 11.51±1.41 670.20±254.36 10.63±0.46 Hypoxia 13.58±1.81*1606.61±295.51*11.61±0.68*2 times 13.07±1.17*1474.95±636.26*11.14±1.084 times 12.91±1.49 1154.93±338.11 11.05±0.688 times 12.84±1.31 1093.67±386.67 10.77±1.17

Fig.1 Changes of blood concentration of ATP in mice exposed to acute hypoxia

3 討論

本實(shí)驗(yàn)觀察到急性低氧暴露后小鼠血糖、丙酮酸、乳酸和肝糖原水平較正常對(duì)照組顯著升高，全血ATP含量降低，但差異無(wú)顯著性，說明在急性低氧條件下，能量產(chǎn)生途徑發(fā)生改變，血糖有氧氧化分解供能被抑制，糖的代謝被迫由有氧氧化向無(wú)氧酵解轉(zhuǎn)移，機(jī)體通過增強(qiáng)無(wú)氧酵解來(lái)適應(yīng)缺氧環(huán)境，導(dǎo)致丙酮酸和乳酸的生成增多，ATP的生成減少。另外，在急性低氧環(huán)境下，基礎(chǔ)代謝率升高使ATP的消耗增加[5]，Howald等證明，缺氧導(dǎo)致細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)破壞，從而造成能量代謝障礙[6]，所以全血ATP含量降低，血糖含量的升高會(huì)使肝糖原分解作用減弱、合成作用相對(duì)增強(qiáng)，肝糖原含量隨之升高;血清尿素氮水平升高，提示蛋白質(zhì)分解代謝加強(qiáng);血清游離脂肪酸和β-羥丁酸水平升高，一般認(rèn)為是脂肪氧化分解增強(qiáng)的結(jié)果[7]，當(dāng)ATP的生成量不足以維持機(jī)體能量的需要時(shí)，脂肪動(dòng)員增強(qiáng)，酮體生成量增多，成為腦和肌肉組織的主要能源，以維持機(jī)體正常的生理功能，也有研究顯示，急性和慢性高原低氧暴露會(huì)顯著降低大鼠肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-1)活性，限制長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體進(jìn)行氧化的過程，造成血清游離脂肪酸含量升高[8]。

聯(lián)合補(bǔ)充維生素B1、B2、PP 后，血糖 、肝糖原、血清丙酮酸、乳酸水平較低氧對(duì)照組有不同程度的降低趨勢(shì)，全血ATP含量有所升高，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步支持向丹英等人的結(jié)論，表明補(bǔ)充維生素后，碳水化合物的有氧氧化增強(qiáng)，無(wú)氧酵解減弱，氧氣的利用率提高，有利于能量生成，這與維生素 B1、B2、PP 作為糖酵解及三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶的輔酶，綜合影響物質(zhì)代謝過程有關(guān)。維生素B1的輔酶形式--焦磷酸硫胺素(thiamine pyrophosphate，TPP)，是丙酮酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶的輔酶，F(xiàn)umagalli等對(duì)正常人缺氧時(shí)靜脈注射TPP 100mg，觀察到該措施可以改善呼吸功能，提高組織對(duì)氧的利用能力[9]，這表明缺氧時(shí)自身TPP不能滿足機(jī)體代謝需要，補(bǔ)充維生素B1有助于促進(jìn)丙酮酸氧化脫羧，從而使三羧酸循環(huán)正常運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)糖的有氧氧化。維生素B2的活性形式--黃素腺嘌呤二核苷酸FAD和黃素單核苷酸FMN，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物，琥珀酸脫氫酶和脂酰CoA脫氫酶的輔酶，維生素PP(煙酰胺)的輔酶形式--NAD+、NADH、NADP+、NADPH，是各種脫氫酶的輔酶，參與了體內(nèi)上百種氧化還原反應(yīng)，NAD作為電子受體參與了糖酵解及三羧酸循環(huán)，另外有研究證明，煙酰胺還可以通過調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)抗細(xì)胞凋亡信號(hào)通路來(lái)增加急性低氧暴露神經(jīng)細(xì)胞的生存力，減少并逆轉(zhuǎn)低氧造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷[10]。

血清游離脂肪酸、β-羥丁酸含量也隨著維生素B1、B2、PP 的補(bǔ)充而有降低趨勢(shì)，說明脂肪酸的β-氧化和酮體的利用增強(qiáng)，提示我們維生素B1、B2、PP可能具有改善急性低氧條件下脂肪氧化不全的狀況。血清尿素氮含量也有下降趨勢(shì)，說明急性低氧條件下，維生素B1、B2、PP的補(bǔ)充可以使蛋白質(zhì)分解減少，節(jié)約了蛋白質(zhì)。

綜上所述，本研究顯示急性低氧暴露后小鼠三大營(yíng)養(yǎng)素代謝發(fā)生了顯著的變化，補(bǔ)充維生素B1、B2、PP對(duì)這種變化具有一定的改善作用。補(bǔ)充劑量不同，所測(cè)指標(biāo)有差別的原因，可能是2倍補(bǔ)充劑量較低，尚不足以有效改善急性低氧暴露造成的物質(zhì)代謝的變化?？傮w來(lái)看，因急性低氧暴露引起的代謝變化有隨著補(bǔ)充劑量的加大而改善的趨勢(shì)，補(bǔ)充正常飼料含量4倍劑量的維生素即可顯示明顯的改善效果。因此，急性低氧環(huán)境下，應(yīng)增加維生素B1、B2、PP的攝入量。有關(guān)上述三種維生素改善急性低氧暴露后物質(zhì)代謝的作用機(jī)制，尚有待于從酶活性或基因表達(dá)水平進(jìn)行深入研究。

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[2]韋京豫，郭長(zhǎng)江，楊繼軍，等.復(fù)合營(yíng)養(yǎng)素制劑對(duì)高原青年?duì)I養(yǎng)狀況與耐低氧能力的干預(yù)作用[J].中國(guó)應(yīng)用生理雜志，2007，23(2):16-19.

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