王艷梅 ，田 歌 ，王陸軍 ，王 燕 ，李 欣 ，趙 明

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030032；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西忻州034000；4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031）

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已成為玉米遺傳育種的有力工具。該技術(shù)為玉米育種、優(yōu)勢類群劃分及雜種優(yōu)勢模式的建立提供了分子水平上的理論依據(jù)，并且加快了選擇育種進(jìn)程，同時為抗性基因的定位、克隆、轉(zhuǎn)化打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。由于SSR標(biāo)記具有引物豐富、多態(tài)性高等特點(diǎn)，利用其進(jìn)行抗病玉米種質(zhì)的遺傳多樣性評價更具優(yōu)勢。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院袁力行等[1]利用4種分子標(biāo)記方法（RFLP，RAPD，AFLP和SSR）研究了玉米自交系的遺傳多樣性，認(rèn)為RFLP，SSR更適合玉米遺傳多樣性的研究。

本研究利用SSR標(biāo)記技術(shù)，以40份絲黑穗病抗性不同的國內(nèi)常用和自選玉米自交系作為試驗(yàn)材料，分析其遺傳多樣性，旨在為抗玉米絲黑穗病種質(zhì)資源的改良及運(yùn)用、抗病自交系和雜交種的選育等育種實(shí)踐提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

選用40份對玉米絲黑穗病具有不同抗性的常用和自選玉米自交系作供試材料，其系譜及抗性列于表1。材料分為2個部分：（1）6份標(biāo)準(zhǔn)測驗(yàn)種，包括黃早四，丹 340，Mo17，B73，掖 478 和齊319，依次代表唐四平頭，旅大紅骨，Lancaster，Reid，PA和 PB這6個類群；（2）34份常用和自選自交系。供試材料均經(jīng)過多年自交，遺傳穩(wěn)定。

表1 40份供試玉米自交系對絲黑穗病的抗性及系譜來源

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與純化 玉米種子在20～30℃暗箱培養(yǎng)4～5 d后，每自交系混合取10株黃化苗葉片，按CTAB法抽提、純化DNA[2-3]。

1.2.2 SSR引物篩選 由上海生物工程公司合成110對SSR引物，以供試玉米材料基因組DNA為模板，篩選出擴(kuò)增條帶清晰[4]、多態(tài)性高的引物57對。

1.2.3 SSR擴(kuò)增 采用20μLPCR反應(yīng)體系：包括 10×buffer（含 Mg2+）2.0μL，2.5 mmol/L dNTPs1.0μL，1 U Taq DNA聚合酶，10μmol/L SSR引物1.0μL，50 ng模板DNA，滅菌無離子水。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃1min，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1min，擴(kuò)增 35 個循環(huán)；72℃延伸10min，最后在4℃保存。擴(kuò)增在PTC-100上完成。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測 擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上分離，銀染檢測[5]，掃描記錄。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 依據(jù)SSR擴(kuò)增檢測結(jié)果，在相同遷移位置有帶記為1，無帶記為0，缺失記為9，建立數(shù)據(jù)庫。遺傳相似系數(shù)（Genetic Similarity，GS）按照公式GS=m/（m＋n）計(jì)算，其中，m為基因型間共有帶數(shù)目，n為基因型間差異帶數(shù)目。按照UPGMA方法對供試自交系進(jìn)行聚類分析。多態(tài)性信息量（PIC）按公式PIC=1－∑Pi2計(jì)算，其中，Pi表示第i個位點(diǎn)等位變異出現(xiàn)的頻率[6]。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均由NTSYS 2.10e軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)分析

本研究從110對SSR引物中篩選出擴(kuò)增帶型清晰穩(wěn)定的57對引物，對40份玉米絲黑穗抗性不同的自交系進(jìn)行擴(kuò)增，總計(jì)10 880個擴(kuò)增帶，其中，76個為雙帶，3個無帶，其余99.3%以上均為單帶。57對SSR引物平均分布于玉米的10條染色體上（表2），在供試材料中共檢測到272個等位基因位點(diǎn)，平均每對引物檢測到4.77個。PIC變化在0.296～0.791之間（表2），平均為0.613，其中4號引物PIC最大，為0.791，46號引物的PIC最小，為0.296。

表2 57對SSR引物擴(kuò)增片段在染色體的位置及對40份自交系擴(kuò)增的多態(tài)性信息量

2.2 40份自交系類群劃分

根據(jù)SSR數(shù)據(jù)得出，40份玉米自交系的遺傳相似系數(shù)（GS）在0.610～0.993之間。利用NTSYS 2.10e軟件，用UPGMA方法建立聚類圖（圖1）。在GS為0.72時，40份自交系分為5大類群[7]（表3）。A群是以黃早四為代表的唐四平頭群，共4份；B群是以丹340為代表的旅大紅骨群，共6份；C群是以Mo17為代表的Lancaster群，共6份；D群是BSSS群，分為2個亞群，以B73為代表的Reid亞群，共2份，以掖478為代表的PA亞群，共6份；E群是以齊319為代表的PB群，共16份。結(jié)合分析供試自交系的系譜資料（表1），利用SSR標(biāo)記劃分的類群與其種質(zhì)類群具有較好的一致性。

2.3 抗絲黑穗病種質(zhì)類群分析

從SSR聚類結(jié)果得出，33個抗病或中抗絲黑穗病的玉米自交系被劃分在5大類群中（表4）。其中，唐四平頭群2份中抗，2份高感；旅大紅骨群和Lancaster群均為中抗或抗；BSSS群中抗以上的種質(zhì)4份，感病的種質(zhì)4份；PB群中有15份中抗以上的品種，只有1份高感種質(zhì)。

表3 40份玉米自交系的SSR標(biāo)記聚類結(jié)果

表4 40份玉米自交系絲黑穗病抗性的類群分布

3 討論

本研究采用SSR標(biāo)記，并在供試自交系中加入6大玉米種群標(biāo)準(zhǔn)測驗(yàn)種，成功將40份玉米自交系聚類劃分為5大種群，其中D群含有2個亞群，劃分結(jié)果與傳統(tǒng)玉米自交系遺傳系譜的劃分結(jié)果[8]一致性很高，并且成功區(qū)分了BSSS的2個亞群Reid群與PA群（Ried改良）。E28與以丹340為代表的旅大紅骨群的遺傳距離較遠(yuǎn)的關(guān)系也得到了正確體現(xiàn)；改65、鄭58-2、鐵7922等均劃入了正確的類群；未知材料Ty93-2被劃入了旅大紅骨群。實(shí)際上玉米育種中優(yōu)良的雜交組合均產(chǎn)生在SSR標(biāo)記聚類劃分的類群間，無一產(chǎn)生在類群內(nèi)。例如，優(yōu)良組合中單2號（Mo17×自 330）、鐵丹 9號（鐵 7922×丹 340）等組合的父母本均產(chǎn)生在不同的類群間，這從實(shí)踐上證明了SSR標(biāo)記技術(shù)是劃分玉米自交系種群的有效工具。

供試材料中33個抗病或中抗絲黑穗病的玉米自交系分布在6個不同類群中，根據(jù)雜種優(yōu)勢利用的原理，均可用于改良類群內(nèi)的感病自交系和選育抗病自交系。尤其是旅大紅骨群、Lancaster群和PB群中抗病自交系較多，可以構(gòu)建抗病種質(zhì)群體。目前，國內(nèi)外開展的玉米絲黑穗病抗源鑒定表明：抗絲黑穗病的玉米種質(zhì)資源并不豐富，尚未發(fā)現(xiàn)絕對免疫材料。希望本研究結(jié)果能為玉米抗絲黑穗病的遺傳機(jī)制闡明、抗玉米絲黑穗病新種質(zhì)和新品種的創(chuàng)新、增強(qiáng)我國玉米抗病種質(zhì)創(chuàng)新能力提供技術(shù)儲備。

［1］ 袁力行，傅駿弊，Warburton M，等.利用 RFLP，SSR，AFLP 和RAPD標(biāo)記分析玉米自交系遺傳多樣性的比較研究[J].遺傳學(xué)報，2000，27（8）：622-627.

［2］ Saghai-Maroof M A，Soliman K M，Jorgensen R A，et al.Ribosmal DNA spacer length polymorphisms in barley:Mendelian inheritance,chromosomal location and population dynamics[J].Proceeing of the National Academy of Science USA，1984，81：8018-8041.

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［4］ 王陸軍，白建榮，王艷梅，等.山西省主推玉米雜交種純度鑒定 SSR核心引物的篩選 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（1）：19-22.

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