靳 輝，黃 洋，岳文斌，張曉強(qiáng)，張春香

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

1997年，美國(guó)John Hopkins大學(xué)的McPherron等[1]從小鼠骨骼肌cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了一種新的生長(zhǎng)分化因子（Growthand Differentiation Factor，GDF），該因子只有1個(gè)可讀框，可編碼376個(gè)氨基酸，具有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）家族的典型特征，但通過(guò)與TGF-β家族其他成員比較，其與TGF-β家族其他成員的同源性很低，最高僅為45%，因而列為TGF-β家族的一類因子——GDF-8。就C端而言，GDF-8基因在不同物種間十分保守，大鼠、人、豬、雞、火雞、小鼠的同源性達(dá)100%[2]。

GDF-8是一種對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)具有負(fù)調(diào)控作用的重要細(xì)胞因子，GDF-8基因的突變或缺失會(huì)導(dǎo)致肌肉細(xì)胞的增生和肌纖維的肥大，該基因敲除的動(dòng)物具有生長(zhǎng)速度快、肌肉含量高、脂肪含量少的特點(diǎn)[1]。利用基因敲除技術(shù)研究GDF-8功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，敲除GDF-8基因的小鼠骨骼肌是正常野生型小鼠的3倍以上，但在其他生長(zhǎng)發(fā)育性狀上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何表現(xiàn)型的差異[1]。GDF-8基因自然突變的雙肌?！壤麜r(shí)藍(lán)牛[3]，其肌肉數(shù)量較一般品種多20%左右，而且肉質(zhì)鮮嫩，極大地提高了飼料轉(zhuǎn)化效率。因此，建立敲除GDF-8基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有廣闊的應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，用紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記的GDF-8基因干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊耳成纖維細(xì)胞，探索其最佳轉(zhuǎn)染條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 表達(dá)載體與菌種 紅色熒光蛋白標(biāo)記的GDF-8基因干擾質(zhì)粒和大腸桿菌DH5α為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 DMEM/F12（Boster），胎牛血清，胰蛋白酶（Solarbio），雙抗（Sigma），LipofectamineTM2000（invitrogen），Opti-MEM（GIBCO）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液的配制 在DMEM/F12中添加10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗所構(gòu)成的培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱基本培養(yǎng)基）用于綿羊耳成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。在DMEM/F12中添加10%FBS，所構(gòu)成的培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱無(wú)抗培養(yǎng)基）用于GDF-8基因干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。

1.2.2 靶細(xì)胞的培養(yǎng) 取1周齡綿羊新鮮耳組織，采用組織塊貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行原代、傳代培養(yǎng)和凍存，建立綿羊耳成纖維細(xì)胞系[4-7]，為脂質(zhì)體介導(dǎo)的GDF-8基因干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染提供靶細(xì)胞。

1.2.3 脂質(zhì)體法介導(dǎo)轉(zhuǎn)靶細(xì)胞 將傳至4代已經(jīng)純化的耳成纖維細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為10 000個(gè)。待細(xì)胞匯合至70%～80%時(shí)，將基本培養(yǎng)基換為無(wú)抗培養(yǎng)基。更換培養(yǎng)基24 h后，細(xì)胞匯合度已達(dá)到90%，按如下步驟進(jìn)行GDF-8基因干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染：（1）將不同量的質(zhì)粒 DNA（0.1，0.2，0.4，0.6 μg） 和不同量的LipofectamineTM2000（0.1，0.5，1.0，1.5 μL）分別稀釋于25μL的Opti-MEM中。然后，將稀釋好的不同量質(zhì)粒DNA和不同量的LipofectamineTM2000兩兩混合，室溫?cái)R置20min，構(gòu)成轉(zhuǎn)染液，加入一個(gè)培養(yǎng)孔中，每個(gè)組合重復(fù)3個(gè)孔，12 h后更換為基本培養(yǎng)基。48 h熒光倒置顯微鏡下檢測(cè)每個(gè)組合表達(dá)紅色熒光蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，用以篩選最佳質(zhì)粒DNA用量和最佳LipofectamineTM2000用量。檢測(cè)時(shí)每個(gè)轉(zhuǎn)染處理組隨機(jī)選取5個(gè)視野，檢測(cè)表達(dá)紅色熒光蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算每個(gè)處理組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均值。（2）用篩選出的最佳質(zhì)粒DNA用量和LipofectamineTM2000用量構(gòu)成轉(zhuǎn)染液，分別于 3，6，12，24，48 h 后更換為基本培養(yǎng)基，每個(gè)時(shí)間重復(fù)3次。48 h熒光倒置顯微鏡下檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染時(shí)間的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，用以篩選最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間。檢測(cè)方法同（1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)染的最佳質(zhì)粒DNA用量和脂質(zhì)體用量

試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)DNA用量為0.4μg，脂質(zhì)體用量為1.0μL時(shí)，不同時(shí)間觀察轉(zhuǎn)染效率均較高。不同時(shí)間觀察的轉(zhuǎn)染效果如圖1所示。

48 h計(jì)算5個(gè)視野平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果如表1所示。

2.2 轉(zhuǎn)染的最佳時(shí)間

用篩選出來(lái)的最佳質(zhì)粒DNA量0.4μg和脂質(zhì)體量1.0μL轉(zhuǎn)染綿羊耳成纖維細(xì)胞，計(jì)算不同時(shí)間后的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6 h時(shí)，可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率（表2）。

表1 48 h不同質(zhì)粒DNA量和不同脂質(zhì)體量轉(zhuǎn)染5個(gè)視野平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 個(gè)

表2 不同轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效果的影響

3 討論

3.1 紅色熒光蛋白（RFP）和陽(yáng)離子脂質(zhì)體法

本試驗(yàn)采用紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記GDF-8基因干擾質(zhì)粒，RFP在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可以直接在熒光倒置顯微鏡下觀察，便于識(shí)別轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞，因此，RFP作為一種理想的標(biāo)記物應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域。目前，陽(yáng)離子脂質(zhì)體法常作為轉(zhuǎn)染外源基因的手段[8]。研究發(fā)現(xiàn)，多種脂類可以在合適的條件下形成小的單層陽(yáng)離子脂質(zhì)體，這些脂質(zhì)體的表面帶有正電荷，能被DNA的磷酸根所吸附，同時(shí)也能被表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜吸附，通過(guò)細(xì)胞融合或胞吞作用使脂質(zhì)體和DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，最終進(jìn)入細(xì)胞核并使外源基因整合到染色體中進(jìn)行基因的表達(dá)[9]。由于不同類型的細(xì)胞吸收大小各異顆粒的能力不盡相同，針對(duì)不同細(xì)胞類型以及所介導(dǎo)的核酸（DNA，RNA或核苷酸），選擇合適的脂質(zhì)體是十分重要的。LipofectamineTM是一種新型脂質(zhì)體，其獨(dú)特的精胺基團(tuán)強(qiáng)正電子頭部可以同時(shí)與帶負(fù)電的DNA和細(xì)胞形成復(fù)合物，大大提高了轉(zhuǎn)染效率。LipofectamineTM作為載體在體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染的研究中已有很多文獻(xiàn)報(bào)道[10]。該方法具有高效、簡(jiǎn)便、對(duì)細(xì)胞損傷小和容易重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)。

3.2 影響轉(zhuǎn)染效果的各種因素

本試驗(yàn)探討了LipofectamineTM2000介導(dǎo)的GDF-8基因干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊耳成纖維細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。首先在轉(zhuǎn)染前24 h，將含抗生素的基本培養(yǎng)基更換為無(wú)抗生素的無(wú)抗培養(yǎng)基，因?yàn)樵诳股卮嬖诘那闆r下不利于轉(zhuǎn)染。另外，試驗(yàn)探索了轉(zhuǎn)染時(shí)的最佳質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體用量以及最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間，由于不同細(xì)胞達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染效果時(shí)所用的DNA量和脂質(zhì)體量是不同的。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)脂質(zhì)體量一定時(shí)，轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨DNA量的增加而增加，但有一個(gè)最大值，超過(guò)這個(gè)最大值時(shí)轉(zhuǎn)染效率降低。當(dāng)DNA量一定時(shí)，轉(zhuǎn)染效率會(huì)隨脂質(zhì)體量的增加而增加，但也有一個(gè)最大值，超過(guò)最大值后轉(zhuǎn)染效率也會(huì)降低。因?yàn)楦邼舛鹊闹|(zhì)體對(duì)細(xì)胞有毒性，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞萎縮、死亡。此外，轉(zhuǎn)染時(shí)間一定程度上也影響著轉(zhuǎn)染效率的高低。以上結(jié)果表明，DNA和脂質(zhì)體用量以及轉(zhuǎn)染時(shí)間會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，欲提高轉(zhuǎn)染效率還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

用GDF-8基因干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染綿羊耳成纖維細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件為：DNA用量為0.4μg，脂質(zhì)體用量為1.0μL，轉(zhuǎn)染時(shí)間為6 h。

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