溫輝芹，裴自友，任永康

（山西省農業(yè)科學院作物科學研究所，山西太原030032）

百薩偃麥草（Thinopyrum bessarabicum，2n=2x=14，JJ）為自花授粉的多年生海岸禾草，原產于黑海和地中海沿岸，是偃麥草屬中基因組最簡單的二倍體物種。J 染色體是偃麥草屬的基本染色體組，在小麥親緣物種中，J 染色體組僅次于S，廣泛分布于多倍體物種中。百薩偃麥草對環(huán)境脅迫和生物脅迫具有很強的抗性，是小麥遺傳改良的重要資源[1]。

分子原位雜交（In Situ Hybridization，ISH）是在分子水平上檢測外源染色質的一種有效方法，根據所用探針不同分為物種?；貜托蛄性浑s交、基因組原位雜交和單拷貝或寡拷貝序列原位雜交等。高等植物的基因組內含有大量的重復DNA 序列，根據其拷貝數將重復序列劃分為衛(wèi)星DNA（高度串聯重復序列）、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA（中度串聯重復序列）、轉座子（中度彌散、具轉座功能）[2]。利用重復序列ISH 分子核型的建立對染色體的識別非常有效。Mukai 等[3]根據pSc119.2和pAs1 這2 個重復序列的雙色原位雜交，建立了普通小麥的分子核型，可以識別全部21 條染色體中的17 條。簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR） 又稱微衛(wèi)星DNA（microsatellites DNA），它是一類由1～6 個堿基組成的基序串聯重復而成的DNA 序列，其長度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置。研究表明，一個基因的不同位點的SSR 在調節(jié)基因的表達和決定產物上起著重要作用。SSR 標記技術已被廣泛用于遺傳圖譜的構建、品種指紋圖譜的繪制以及目標性狀基因標記篩選、起源進化等領域[4]。Pedersen等[5-6]發(fā)現，來自大麥的pHvG38 克隆（GAA-衛(wèi)星序列）可以在大麥、小麥、黑麥以及其他小麥族物種染色體上產生與N-帶完全一致的核型圖譜，利用pHvG38 和克隆pAs1 的雙色原位雜交建立了可以區(qū)分普通小麥全部21 條染色體的分子核型。目前，利用標記的簡單重復序列進行的原位雜交開展了對甜菜、鷹嘴豆、六倍體普通小麥、大麥、黑麥、小黑麥、果蠅和人類染色體上微衛(wèi)星物理位點的研究[5，7-13]。

本研究以簡單重復序列（AAG）5為探針，進行熒光原位雜交，檢測其在百薩偃麥草上的位置，建立百薩偃麥草的（AAG）5熒光核型。

1 材料和方法

1.1 材料

百薩偃麥草由山西省農業(yè)科學院作物科學研究所保存。簡單重復序列（AAG）5由日本葛萊娜有限公司合成、日本鳥取大學農學部植物遺傳育種實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 根尖細胞染色體制片 百薩偃麥草種子發(fā)芽前先浸種處理24 h，然后將種子放在墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿內于4 ℃冰箱中處理1 周左右，再放到23 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽，待根長約1～2 cm 時剪取根尖，在冰水中預處理22～24 h 后，用酒精-冰醋酸（3∶1）固定液固定。用45%醋酸洋紅制片，-70 ℃冰箱冰凍揭片。

1.2.2 探針標記 采用3′末端標記方法（3′End labeling method），用tetramethyl-rhodamine-5-dUTP 標記合成的簡單重復序列（AAG）5。反應液配制：將1.5 mL 離心管置于冰上，依次加入5×TdT Reaction buffer 4 μL，終濃度為100 pmol/L的（AAG）5，CoCl2（25 mmol/L）4 μL，tetramethyl-rhodamine-5-dUTP（25 nmol/μL，Roche）1 μL，Terminal Transferase rec 1 μL，最后加ddH2O 至總體積為20 μL，混合、離心后，37 ℃溫育15 min，再將離心管置于冰上，加入Stop buffer（0.2 mol/L EDTA，pH 值為8.0）2 L，混勻，放入-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 熒光原位雜交（FISH）及信號檢測 熒光原位雜交主要參照Kishii 等[14]的程序，具體如下。

（1）制片變性：根尖制片放置于0.2 mol/L NaOH/70%Ethanol，室溫條件下5 min，變性后的制片在-20 ℃的70%，90%，100%乙醇溶液中各5 min 梯度脫水，雜交前氣干備用。

（2）雜交液配制及變性：每10 μL 雜交液含去離子甲酰胺（Formamide）5 μL，50% Dextran sulfate 2 μL，20×SSC 1μL，探針（AAG）50.5 μL，ddH2O 1.5 μL。輕輕混勻，100 ℃下變性5 min，然后立即放置于碎冰中冷卻5 min 以上。

（3）雜交：每張制片加10 μL 探針混合液，用18 mm×18 mm 的蓋玻片蓋好（膠水封住四周），放置于有濕潤濾紙的塑料盒內，37 ℃雜交過夜。

（4）洗片：取出充分雜交的制片，用鑷子小心去掉膠水和蓋玻片，在0.1%TritonX-100/2×SSC室溫下洗脫5 min，2×SSC 室溫浸洗5 min，用洗耳球吹干。

（5）染色及鏡檢：制片加10 μL 用VECTA shield（Vector）膠配置的DAPI 套染和封片，蓋上蓋片（20 mm×20 mm），用Olympus BX61 熒光顯微鏡觀察、照相。各染色體根據臂比和熒光帶型用Adobe PhotoShop 6.0 軟件編輯排列。

2 結果與分析

以簡單重復序列（AAG）5為探針，對百薩偃麥草的熒光原位雜交結果如圖1 所示。圖1 結果表明，（AAG）5在百薩偃麥草的絕大部分染色體上具有明顯的熒光帶紋，可以很好地將7 對百薩偃麥草染色體區(qū)分開來。熒光信號在不同的百薩偃麥草染色體上的強弱不同，而且在不同位點也有變化，信號的強弱反映了拷貝數的多少。

由于百薩偃麥草每條染色體所屬的部分同源群尚不清楚，用J1～J7表示百薩偃麥草7 對染色體，建立了百薩偃麥草7 對染色體的（AAG）5熒光原位雜交核型排列圖（圖2）。各染色體（AAG）5熒光帶型特征為：染色體J1，染色體最長，有很弱的著絲粒帶和長臂中間帶；染色體J2，染色體短臂無帶、具長臂中間帶；染色體J3，無明顯帶紋；染色體J4，有較強的著絲粒帶，長臂具近著絲粒帶；染色體J5，長、短臂均有強的近著絲粒帶；染色體J6，具有著絲粒帶、長臂近著絲粒帶和中間帶；染色體J7，具有著絲粒帶。

3 討論

簡單重復序列分布于編碼區(qū)和非編碼區(qū)，通常與異染色質相關聯。許多重復序列在小麥近緣種甚至不同屬間是共享的，但在不同基因組中分布模式是不同的[2]。簡單重復序列的FISH 結果表明，SSR 在染色體上有成簇分布的，也有彌散分布的[15]。目前，利用的有單堿基、2 個堿基、3 個堿基和4 個堿基重復的長度在15～20 bp 的簡單重復序列，并建立了在有絲分裂、減數分裂染色體和線性染色體上鑒定目的簡單重復序列富集區(qū)的非變性熒光原位雜交方法[16]，這將有益于基因組分析和簡單重復序列在染色體上的結構功能的研究。合成的寡核苷酸探針（簡單重復序列）由于鏈短，其序列復雜度低，相對分子質量小，雜交效率明顯高于長探針；寡核苷酸探針可識別靶序列內1 個堿基的變化，具有可大量人工合成、價格低廉等獨特的優(yōu)點。通過高度重復序列與簡單重復序列作探針的多色FISH 和多重FISH 技術已被廣泛應用于構建染色體物理圖譜，進行基因組分析、核型關系、遺傳多樣性和進化的研究，還可發(fā)現進化過程中的染色體重排。

已有45SrDNA 在百薩偃麥草染色體上的分布研究[17-18]，今后應進一步結合其他的重復序列，如pAs1，pSc119，pTa794（5SrDNA）和簡單重復序列的熒光原位雜交相結合對同一個有絲分裂中期細胞的染色體進行連續(xù)、多色FISH，建立每條染色體的綜合熒光核型。本研究表明，（AAG）5在供試的百薩偃麥草的各染色體間存在很大的差別，百薩偃麥草（AAG）5位點的鑒定，為在分子水平上研究小麥族的物種起源與進化提供了新的信息。本研究中發(fā)現用熒光素（Fluorescein-12-dUTP）標記（AAG）5的效果（熒光信號強度）要差些，因此，在采用熒光素標記作探針時，雜交液中要適當加大探針的用量，以獲得理想的效果。這與王蘇玲和莊麗芳等[19-20]的研究結果一致。本研究未發(fā)現百薩偃麥草有明顯的隨體染色體，而Endo 等[21]的結果卻顯示百薩偃麥草具有2 對隨體染色體。具體各同源群的百薩偃麥草染色體熒光帶型的確定還需要利用全套的中國春-百薩偃麥草二體異附加系作進一步研究，但研究發(fā)現導入小麥背景的百薩偃麥草染色體存在染色體重排現象[22]，因為染色體結構的微小變化往往表現為帶型的多態(tài)性。說明在百薩偃麥草的進化過程中經歷了較多的變化，為今后的鑒定帶來了一定的難度。

不同物種的染色體C-分帶帶型有明顯的差異，因而可用作鑒別物種的依據[19]。染色體分帶作為常用的細胞學鑒定手段，其效果受染色體制片質量和吉姆薩（Giemsa）染液的影響較大。利用重復序列的染色體識別技術是分帶技術的有益補充。分帶大多只能在組成性異染色質區(qū)產生帶紋，對于異染色質少的染色體的鑒定往往成效不大。利用不同的重復序列探針可以產生不同的分子核型，基因組原位雜交（GISH）、多個重復序列探針相結合的雙色或多色FISH 技術以及分子標記等多種技術相結合可以更高效地識別染色體的身份。

［1］裴自友，溫輝芹，陳華鋒，等.百薩偃麥草在小麥遺傳改良中的應用研究進展[J].陜西農業(yè)科學，2008，54（1）：70-74.

［2］張學勇，李大勇.小麥及其近親基因組中的DNA 重復序列研究進展[J].中國農業(yè)科學，2000，33（5）：14-24.

［3］Mukai Y，Nakahara Y，Yamamoto M. Simultaneous discrimination of the three genomes in hexaploid wheat by multicolor fluorescence in situ hybridization using total genomic and highly repeated DNA probes[J].Genome，1993，36：489-494.

［4］李麗，王海崗，張曉麗，等.SSR 分子標記在作物遺傳育種中的應用[J].山西農業(yè)科學，2008，36（3）：15-18.

［5］ Pedersen C，Rasmussen S K，Linde-Laursen I. Genome and chromosome identification in cultivated barley and related species of the Triticeae（Poaceae）by in situ hybridization with the GAA-satellite sequence[J].Genome，1996，39：93-104.

［6］Pedersen C，Langridge P.Identification of the entire chromosome complement of bread wheat by two-colour FISH [J]. Genome，1997，40：589-593.

［7］Schmidt T，Heslop-Harrison J S. The physical and genomic organization of microsatellites in sugar beet [J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：8761-8765.

［8］Gortner G，Nenno M，Weising K，et al.Chromosomal localization and distribution of SSRs and the Arabidopsis-type telomere sequence in the genome of Cicer arietinum L[J].Chromosome Res，1998，6：97-104.

［9］Cuadrado A，Schwarzacher T. The chromosomal organization of simple sequence repeats in wheat and rye genomes [J].Chromosoma，1998，107：587-594.

［10］Cuadrado A，Schwarzacher T，Jouve N. Identification of different chromatin classes in wheat using in situ hybridization with simple sequence repeat oligonucleotides[J].Theor Appl Genet，2000，101：711-717.

［11］Cuadrado A，Cardoso M，Jouve N.Physical organisation of simple sequence repeats（SSRs）in Triticeae:structural，functionaland evolutionary impliations [J]. Cytogenet Genome Res，2008，120：210-219.

［12］Cuadrado A，Jouve N.Similarities in the chromosomal distribution of AG and AC repeats within and between Drosophila，human and barley chromosomes [J]. Cytogenet Genome Res，2007，119：91-99.

［13］ Cuadrado A，Jouve N. The non-random distribution of long clusters of all possible classes of trinucleotide repeats in barley chromosomes[J].Chromosome Res，2007，15：711-720.

［14］Kishii M，Nagaki K，Tsujimoto H，et al.Exclusive localization of tandem repetitive sequences in subtelomeric heterochromatin regions of Leymus racemosus（Poaceae，Triticeae）[J]. Chromosome Res，1999，7：519-529.

［15］ Cuadrado A，Cardoso M，Jouve N. Increasing the physical markers of wheat chromosomes using SSRs as FISH probes[J].Genome，2008，51：809-815.

［16］ Cuadrado A，Jouve N. Chromosomal detection of simple sequence repeats（SSRs）using nondenaturing FISH（ND-FISH）[J].Chromosoma，2010，119：495-503.

［17］Li D Y，Zhang X Y.Physical localization of the 18S-5·8S-26S rDNA and sequence analysis of ITS regions in Thinopyrum ponticum（Poaceae: Triticeae）：Implications for concerted evolution[J].Annals of Botany，2002，90：445-452.

［18］裴自友，溫輝芹，莊麗芳，等.45S rDNA 在百薩偃麥草染色體上的分布[J].中國農學通報，2007，23（11）：86-89.

［19］高紅云，蘇亞蕊，張大樂，等.節(jié)節(jié)麥-黑麥雙二倍體的染色體C-帶分析[J].華北農學報，2006，21（2）：46-49.

［20］莊麗芳，亓增軍，英加，等.普通小麥-百薩偃麥草（Thinopyrum bessarabicum）二體異附加系的選育與鑒定[J].遺傳學報，2003，30（10）：919-925.

［21］ Endo T R，Gill B S. The heterochromatin distribution and genome evolution in diploid species of Elymus and Agropyron[J].Can J Genet Cytol，1984，26：669-678.

［22］陳華鋒，錢保俐，莊麗芳，等.普通小麥中國春-百薩偃麥草異染色體系的分子標記分析[J].作物學報，2007，33（8）：1232-1239.