張亞明

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院,江蘇鹽城,224001)

抗感顆粒為金銀花、赤芍、綿馬貫眾經(jīng)加工制成的顆粒。具有清熱解毒的功能,主治外感風(fēng)熱引起的感冒。綠原酸被認(rèn)為是抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分,通常被作為定性定量的指標(biāo)?！吨袊?guó)藥典》2010年版采用薄層層析法對(duì)綠原酸進(jìn)行定性鑒別,未收載測(cè)定含量的方法[1]。文獻(xiàn)有采用薄層掃描法[2],RP-HPLC[3-4],HPLC法[5-8],二階導(dǎo)數(shù)紫外光譜法[9]和分光光度法[10]測(cè)定綠原酸含量的報(bào)道。為有效控制抗感顆粒的質(zhì)量,探索綠原酸含量測(cè)定新方法,本文對(duì)用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLCELSD)測(cè)定抗感顆粒中綠原酸含量的方法進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

LC-10AT vp型高效液相色譜儀(日本島津公司),Varian 380-LC型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)瓦里安公司),SPD-10A vp型紫外檢測(cè)器(日本島津公司)HW-2000色譜工作站,AS230自動(dòng)進(jìn)樣器,AT330柱溫箱,CA-3型靜音無(wú)油空氣泵,BP211D電子天平,6171型pH/mv測(cè)試器,CQ-250型超聲波清洗器(上海必能信超聲有限公司)。

綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):110753-200413,供含量測(cè)定用),抗感顆粒(貴州盛世龍方制藥股份有限公司,批號(hào):20090612,20090628,20090705);乙腈為一級(jí)色譜純,水為重蒸餾水;其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Lichrospher C18,4.6 mm×150 mm,5 μ m;流動(dòng)相:0.5%冰醋酸水溶液-乙腈(75:25);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μ L。ELSD 條件:漂移管溫度為90 ℃,載氣1.6 Bar。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算不低于2000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h以上的綠原酸對(duì)照品50.18 mg,置50 mL量瓶中,加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.2.2 供試品溶液的制備:取本品,研細(xì),取約1 g,精密稱定,置具塞棕色瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率 40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取濾液,用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過(guò),取續(xù)濾液,置棕色瓶中,即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密量取2.2.1中的對(duì)照品溶液2 mL、3 mL、4 mL 、5 mL 置10 mL的量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。取以上4種濃度溶液及2.2.1中的對(duì)照品溶液各20 μ L注入液相色譜儀,測(cè)定。以峰面積的對(duì)數(shù)值與濃度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行線性回歸,得回歸方程LogC=0.63512LogA-4.4523,r=0.9997,表明濃度在0.2～1 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一樣品溶液,每隔2 h進(jìn)樣1次,測(cè)定5次,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.63%。

2.5 回收率試驗(yàn)

分別精密量取2.2.1中的對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、3 mL置10 mL的量瓶中,加供試品溶液稀釋至刻度,搖勻。取以上3種濃度溶液各20 μ L注入液相色譜儀,測(cè)定。每種濃度連續(xù)進(jìn)樣3次,取其平均值計(jì)算。結(jié)果平均回收率為99.5%。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取2.2.1中的對(duì)照品溶液5 mL置10 mL量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,重復(fù)進(jìn)樣6次,RSD為0.35%。

2.7 樣品含量測(cè)定

取 2.2.2 供試品溶液 ,濾過(guò) ,進(jìn)樣 20 μ L,按2.1條件測(cè)定,用2.3回歸方程計(jì)算供試品的含量,測(cè)定3批樣品,平行測(cè)定4次,3批樣品的含量平均值分別為99.8%、99.6%、99.8%,RSD分別為0.39%、0.48%、0.44%。

3 討 論

抗感顆粒可清熱解毒,用于外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱、頭痛、鼻塞、噴嚏、咽痛、全身乏力、酸痛等癥[11-12]?？垢蓄w粒中的主要成分金銀花藥用歷史悠久,為常用的清熱解毒藥,它的作用廣泛,具有清熱解毒、散風(fēng)消腫的功能,主治風(fēng)熱感冒、肺炎、咽喉腫痛、急性細(xì)菌性痢疾、嬰幼兒腹瀉等證。金銀花屬于忍冬科,主要含有綠原酸、異綠原酸、揮發(fā)油、咖啡酸、黃酮、皂苷等。按2005版中國(guó)藥典規(guī)定,金銀花中的標(biāo)志性成分是綠原酸和木犀草苷,綠原酸常作為金銀花質(zhì)量控制的指標(biāo)成分[13-14]。因?yàn)榫G原酸和木犀草苷的最大吸收波長(zhǎng)不致,所以需要分別用HPLC法測(cè)定綠原酸和木犀草苷的含量,增加了檢測(cè)工作量。

ELSD是一種通用質(zhì)量型檢測(cè)器,可以克服紫外檢測(cè)器的以上缺點(diǎn),對(duì)測(cè)定條件下所有通過(guò)漂移管仍未蒸發(fā)的氣化的固體顆粒都會(huì)響應(yīng),因而對(duì)持續(xù)通過(guò)漂移管的流動(dòng)相要求應(yīng)全部揮發(fā)。因此本文采用ELSD檢測(cè)器對(duì)其進(jìn)行同時(shí)測(cè)定,研究結(jié)果顯示,應(yīng)用ELSD檢測(cè)器,可充分排除流動(dòng)相紫外吸收對(duì)含量測(cè)定的影響,此法準(zhǔn)確,精密度、重現(xiàn)性好、回收率高,為金銀花藥材的質(zhì)量控制提供了快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。研究發(fā)現(xiàn)載氣流速和漂移管的溫度對(duì)ELSD的檢測(cè)性能有較大影響,在儀器規(guī)定的參數(shù)范圍內(nèi)經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn),最終確定ELSD檢測(cè)器的參數(shù)為漂移管溫度為90℃,載氣1.6 Bar。在實(shí)驗(yàn)中,我們選擇了醋酸-水-乙腈體系,將綠原酸有效洗脫出來(lái),且可全部揮發(fā)以減少其對(duì)測(cè)定的影響。蒸發(fā)光檢測(cè)器靈敏度較高,檢出限可達(dá)10 ng。在本實(shí)驗(yàn)條件下,綠原酸的檢測(cè)限為30 ng(S/N=2),完全能夠滿足檢測(cè)要求。此色譜條件可同時(shí)用于含綠原酸的其它中成藥的含量測(cè)定。亦可用于這類藥物的鑒別。

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