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        E2F1通過調節(jié)自噬相關蛋白表達促進卵巢癌細胞耐藥

        2020-05-29 11:44:50李千會陳說趙楊
        中國醫(yī)科大學學報 2020年5期
        關鍵詞:結果顯示孵育卵巢癌

        李千會,陳說,趙楊

        (中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科,沈陽 110001)

        卵巢癌是最致命的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,死亡率較高[1]。卵巢癌在早期階段沒有明顯癥狀,因此,大多數(shù)患者在初診時已處于晚期[2]。腫瘤切除手術聯(lián)合鉑類藥物化學治療(簡稱化療)可用于多種實體腫瘤的治療。順鉑自1989年開始被廣泛用于治療卵巢癌,但許多患者可出現(xiàn)順鉑耐藥及腫瘤復發(fā),且順鉑耐藥的具體機制目前尚不明確[3]。E2F轉錄因子1(E2F transcription factor 1,E2F1)屬于E2F轉錄因子家族,參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥[4-7]。本研究組在前期研究[8]中發(fā)現(xiàn),E2F1可通過調節(jié)miR-519d/RhoC途徑促進卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。然而,E2F1是否參與卵巢癌耐藥尚未見文獻報道。因此,本研究擬探討E2F1在卵巢癌細胞耐藥中的作用及其可能的機制。

        1 材料與方法

        1.1 細胞培養(yǎng)和轉染

        用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone Logan公司)培養(yǎng)人卵巢癌細胞株A2780。另用含20 ng/mL順鉑的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人卵巢癌順鉑耐藥株A2780/DDP。在常規(guī)培養(yǎng)期間,每2 d更換1次培養(yǎng)基。按照說明書用lipofectamine 3000(美國Invitrogen公司)進行細胞轉染,分別用E2F1過表達質粒及小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉染A2780/DDP細胞,上調或下調E2F1的表達。

        1.2 MTT

        將細胞消化后接種于96孔板中(3×103/孔),孵育12 h,加入不同濃度的順鉑。待細胞培養(yǎng)48 h后加入5 mg/mL MTT(中國Solarbio公司)20 μL/孔,37 ℃孵育4 h,除去培養(yǎng)基/MTT溶液,加入DMSO(150 μL/孔)。使用微孔板分光光度計(美國Bio-Tek Instruments公司)測量吸光度。

        1.3 RT-PCR

        用TRIzol試劑盒(日本TaKaRa公司)從A2780、A2780/DDP及分別轉染了E2F1過表達質粒和si-RNA的A2780/DDP細胞中提取總RNA,按照說明書逆轉錄cDNA。基于GenBank序列設計引物。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(日本TaKaRa公司)進行RT-qPCR擴增。GAPDH用作內參基因。E2F1引物序列如下:F,5'-AACCGCTGTTGTCCCG-3';R,5'-CAAGCCCT GTCAGAAATCC-3'。GAPDH引物序列如下:F,5'-A GCCTCAAGATCATCAGCAATG-3';R,5'-CACGAT ACCAAAGTTGTCATGGAT-3'。

        1.4 Western blotting

        變性蛋白(40 μg)上樣,10%或15%SDS-PAGE凝膠電泳分離,轉移至Hybond膜(德國Amersham公司),于3%牛血清白蛋白中37 ℃封閉2 h。加入一抗[E2F1抗體1︰1 000稀釋、自噬相關蛋白7(autophagy related 7 homolog,ATG7)抗體1︰1 000稀 釋、死骨片蛋白(sequestosome 1,P62/SQSTM1)抗體1︰1 000稀釋、自噬相關蛋白10(autophagy related 10 homolog,ATG10)抗 體1︰1 000稀 釋,美國Proteintech公司;切除修復交叉互補蛋白1(excision repair cross-complementing group 1,ERCC1)抗體1︰300稀釋、ATP結合蛋白C1(ATP-binding cassette,sub-family C member 1,ABCC1)抗 體1 ︰300稀釋、ATP結合蛋白G2(ATP-binding cassette subfamily G member 2,ABCG2)抗體1︰300稀釋,中國北京Bioss公司;微管相關蛋白1輕鏈3(microtubuleassociated protein 1 light chain 3 beta,LC3)抗體1︰1 000稀釋,美國 Cell Signaling Technology公司],4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min×3次,加入抗小鼠/兔IgG抗體(1︰5 000,美國Proteintech公司),室溫下孵育2 h,洗膜10 min×3次。ECL Plus檢測顯影。β-actin(1︰3 000稀釋,美國 Proteintech公司)用作內參照。

        1.5 免疫熒光染色

        在培養(yǎng)板中將融合度達到 60%~80%的細胞爬片用PBS浸洗5 min×3次。4%甲醛固定30 min。PBS洗滌3次,0.2%Triton X-100室溫下透化30 min。PBS洗滌3次,3%BSA 室溫下封閉30 min。加入一抗ATG7(1︰100稀釋)、ATG10(1︰100稀釋)、LC3(1︰100稀釋)、P62(1︰100稀釋),4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次,加入TRITC標記的二抗,室溫下暗箱中孵育2 h,洗滌,DAPI孵育5 min,PBS洗滌。熒光顯微鏡下拍照。

        1.6 統(tǒng)計學分析

        2 結果

        2.1 A2780/DDP細胞中E2F1表達水平高于A2780細胞

        MTT檢測結果顯示,卵巢癌細胞系順鉑耐藥株A2780/DDP(IC50:26.5 μmol/L)對順鉑的耐藥性高于親本A2780細胞(IC50:13.9 μmol/L),差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05),見圖1A。

        RT-PCR及Western blotting結果顯示,A2780/DDP細胞中E2F1mRNA和蛋白質表達水平顯著高于A2780細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05),見圖1B、1C。

        2.2 E2F1參與卵巢癌細胞耐藥

        通過轉染E2F1過表達質?;駿2F1 siRNA,上調或下調A2780/DDP中E2F1的表達,并應用Western blotting 及RT-PCR檢測轉染效率。結果顯示,轉染E2F1過表達質粒后,A2780/DDP細胞中E2F1mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P< 0.05,圖2A、2C);在A2780/DDP細胞中轉染E2F1 siRNA,E2F1mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P< 0.05,圖2B、2D)。

        圖1 A2780/DDP細胞中E2F1mRNA和蛋白表達水平高于A2780細胞Fig.1 E2F1mRNA and protein were expressed at higher levels in cisplatin-resistant ovarian cancer cell line A2780/DDP than parental A2780

        圖2 E2F1過表達質粒/E2F1 siRNA轉染上調/下調了E2F1的表達Fig.2 Transfection of E2F1 overexpression plasmid or E2F1 siRNA upregulates or downregulates the expression of E2F1

        MTT結果顯示,E2F1的過表達降低了A2780/DDP細胞對順鉑的敏感性(P< 0.05,圖3A);沉默E2F1具有相反的作用(P< 0.05,圖3B)。表明E2F1能增強卵巢癌細胞的順鉑耐藥性。

        2.3 改變 E2F1 表達不影響耐藥相關蛋白的表達

        Western blotting結果顯示,A2780/DDP細胞中E2F1的過表達或低表達對 ERCC1、ABCC1或ABCG2的蛋白表達水平無顯著影響(圖4)。表明E2F1并非通過調節(jié)耐藥相關蛋白增強卵巢癌細胞的順鉑耐藥性。

        2.4 E2F1通過調節(jié)自噬相關蛋白表達影響卵巢癌細胞耐藥

        本研究分別在A2780/DDP與A2780細胞中檢測了自噬相關蛋白ATG7、ATG10、LC3、P62的表達水平。結果顯示,與A2780細胞相比,A2780/DDP細胞中ATG7、ATG10和LC3蛋白表達水平升高,P62表達水平降低(圖5)。提示自噬可能在卵巢癌細胞順鉑耐藥中發(fā)揮作用。

        用順鉑處理的A2780/DDP細胞中E2F1的過表達增加了ATG7、ATG10和LC3的表達,并降低P62表達;而E2F1的敲低具有相反的效果(圖6)。這些結果證實,E2F1的過表達促進了A2780/DDP細胞中順鉑誘導的保護性自噬。

        圖3 E2F1參與卵巢癌細胞耐藥Fig.3 E2F1 is involved in ovarian cancer cell resistance

        圖4 改變 E2F1 表達不影響耐藥相關蛋白的表達Fig.4 Altering E2F1 expression does not affect the expression of proteins involved in drug resistance

        圖5 自噬相關蛋白在A2780/DDP與A2780中的表達Fig.5 Differential expression of autophagy-related proteins in A2780/DDP and A2780 cells

        3 討論

        E2F1在腫瘤組織中過表達可促進卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展[7]。本研究結果顯示,順鉑耐藥卵巢癌細胞系E2F1表達水平高于親本卵巢癌細胞系,而且轉染編碼E2F1的質粒降低了A2780/DDP細胞對順鉑的敏感性,而沉默E2F1則具有相反的作用,表明E2F1參與了卵巢癌的順鉑耐藥。

        腫瘤細胞耐藥性與耐藥相關基因的表達水平相關。ERCC1參與某些癌癥中順鉑抗性的發(fā)展[9-10]。乳腺癌耐藥蛋白BCRP/ABCG2是ATP結合盒(ATPbinding cassette,ABC)家族中的藥物轉運蛋白,在化療耐藥中起著至關重要的作用[11-12]。ABCC1也稱為多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistanceassociated protein 1,MRP1),與多種癌細胞系的耐藥性相關[13-14]。本研究通過評估耐藥相關基因的表達水平,探討了E2F1增強卵巢癌耐藥性的分子機制。結果顯示,在A2780/DDP細胞中過表達或敲低E2F1后,ERCC1、ABCC1和ABCG2的表達水并無改變,提示這些蛋白可能并未參與 E2F1誘導的卵巢癌順鉑耐藥。因此,E2F1可能通過調節(jié)其他基因促進卵巢癌順鉑耐藥性。

        圖6 E2F1通過調節(jié)自噬相關蛋白表達影響卵巢癌細胞耐藥Fig.6 E2F1 promotes cisplatin resistance in ovarian cancer cells by regulating the expression of autophagy-related proteins

        越來越多的研究表明自噬在腫瘤耐藥中起重要作用。自噬是一種進化上保守的過程,通過對長壽蛋白和功能失調細胞器的降解和更新提供代謝支持,以維持細胞穩(wěn)態(tài)。自噬在細胞正常基礎代謝水平持續(xù)發(fā)生,在應對饑餓、氧化應激或藥物治療等應激時上調[15]。腫瘤細胞可通過誘導自噬對抗腫瘤治療藥物產生耐藥性[16-18]。LC3-Ⅱ是監(jiān)測哺乳動物自噬和自噬相關過程的可靠標記[19],P62(SQSTM1)累積表示對自噬體的清除被阻斷。當LC3-Ⅱ上調時,P62下調,表明自噬正在進行,反之表示自噬過程被抑制[20]。ATG8和ATG12是形成自噬體所需的遍在蛋白樣蛋白,ATG7是E1樣連接酶,而ATG10是E2樣連接酶,后二者對ATG12的綴合都是必需的。以上這些蛋白質的改變可導致自噬的喪失。在ATG8系統(tǒng)中,ATG12-ATG5綴合物能促進ATG8和磷脂酰乙醇胺之間的綴合,而ATG10以E3-酶非依賴性方式促進ATG12-ATG5綴合。增強的ATG7和ATG10水平足以誘導自噬[21]。本研究結果顯示,與A2780細胞相比,順鉑耐藥卵巢癌細胞系A2780/DDP中ATG7、ATG10、LC3表達水平升高,P62表達水平降低,提示順鉑耐藥可能與A2780/DDP細胞中的自噬有關。研究[22-23]表明,E2F1通過參與相關的信號通路影響自噬。本研究發(fā)現(xiàn),E2F1的過表達增加了ATG7、ATG10和LC3蛋白的表達,降低了P62的表達,而沉默E2F1則具有相反的效果。以上結果表明E2F1可能通過增加自噬導致卵巢癌細胞對順鉑的耐藥。

        綜上所述,本研究表明 E2F1 可通過調節(jié)自噬相關蛋白,誘導卵巢癌細胞保護性自噬,并增強卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性。

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