楊季紅 程樹杰

近年來，表觀遺傳學(xué)成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點，尤其是基因印跡在人類遺傳性疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用正引起越來越多研究者的注意［1，2］，這種表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象正在逐漸成為國內(nèi)外學(xué)者的研究重點?；蚪M印跡是一種導(dǎo)致父源性或者母源性等位基因表達的染色體修飾，由于其在新生命誕生時就已經(jīng)形成，所以這種修飾很可能是一種癌前事件，尤其是胰島素樣生長因子-2(IGF-2)/H19這組印跡基因，兩者的印跡缺失已經(jīng)被認為是癌癥發(fā)生的早期事件［3］。因此對基因印跡的研究可能為癌癥的早期診斷提供一些準確的生物學(xué)指標(biāo)。

1 基因印跡

基因印跡(Gene Imprinting)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種不遵從孟德爾定律的、僅僅依靠單親傳遞某些遺傳學(xué)性狀的特殊現(xiàn)象，也就是某些基因呈親源依賴性的單等位基因表達，而其另一個等位基因不表達或者表達極弱，仿佛這些基因的不同親本來源的一對等位基因上帶有某種特殊的可供識別的印跡，故亦稱作基因組印跡(Genomic Imprinting)、配子印跡(GameticImprinting)或親源印跡(Parental Imprinting)。具有這種現(xiàn)象的基因稱為印跡基因(Imprinted Genes)?；蛴≯E的產(chǎn)生及其控制機制是十分復(fù)雜的，目前所知仍然有限;DNA差異性甲基化、特殊的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等均可能在其產(chǎn)生及維持過程中占有比較重要的地位，其中最具重要的是DNA差異性甲基化?；蛴≯E的異?？赡芤韵率鋈N形式參與腫瘤的發(fā)生［2］:(1)印跡的抑癌基因的雜合性丟失(LOH)或單親二倍體(UPD)或突變失活可能會導(dǎo)致某個抑癌基因的惟一有功能的拷貝的丟失或不表達;(2)印跡的癌基因的印跡丟失(LOI)或單親二倍體(UPD)則可能導(dǎo)致雙等位基因表達，表達量成倍增加;(3)印跡控制中心(DMR或ICR、指理論上可能會存在的某些對印跡現(xiàn)象有關(guān)鍵性影響的基因或順式元件)的突變性失活，可能會導(dǎo)致某個染色體印跡區(qū)域的多個印跡的癌基因的不正常表達。目前已知的與腫瘤相關(guān)的印跡基因至少有25種之多，如IGF-2、H19、p73、NOEY2 等。

2 DNA甲基化

自從Jones等［4］在1999年研究發(fā)現(xiàn)包括DNA甲基化在內(nèi)的共價修飾這一表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象同樣可以導(dǎo)致抑癌基因失活，致使癌腫發(fā)生，而且存在的范圍較基因突變更為廣泛以來，研究DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，可能存在于所有高等生物中，它是由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶催化，以s-腺苷蛋氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶的一種反應(yīng)［5］。由于DNA局部甲基化增強在腫瘤中最為常見，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，已被認為是腫瘤抑癌基因滅活的重要原因，使其成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點之一［6］。目前已報道的與腫瘤相關(guān)的甲基化基因較多，如細胞周期負調(diào)控基因RASSFIA及ppENK等、錯配修復(fù)基因hMLH-1等、細胞黏附分子CD44等以及IGF2、H19、降鈣素等，這些基因的甲基化異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［7］。

3 H19基因的研究進展

H19基因?qū)儆诎l(fā)育印跡基因，父源印跡、母源表達。H19基因定位于小鼠7號染色體的遠端、定位人染色體11p15.5，系一單拷貝基因，人類H19基因全長為3kb，共含有5個外顯子及4個內(nèi)含子。在第5外顯子上有RsaⅠ多態(tài)性酶切位點［8］。H19 mRNA有35個小的開放閱讀框(ORF)，最大的開放閱讀框是ORF6，其起始于第一個外顯子，終止于第二個外顯子，理論上可以潛在編碼一個含256個氨基酸的蛋白質(zhì)分子，但是在體內(nèi)以及各種細胞系中都檢測不到任何與這些開放閱讀框相對應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而且尚未發(fā)現(xiàn)H19基因與翻譯系統(tǒng)有聯(lián)系，因此大多學(xué)者認為H19基因是目前發(fā)現(xiàn)的惟一不表達蛋白質(zhì)的印跡基因，而是在mRNA水平發(fā)揮其作用［9］，其在人和小鼠的胚胎期廣泛表達，參與胚胎的正常生長、發(fā)育及小兒的行為發(fā)展。H19基因與以往發(fā)現(xiàn)的p53、Rb等基因一樣均為抑癌基因，是一種人類發(fā)育印跡基因［10］。在許多腫瘤細胞株研究中發(fā)現(xiàn)，H19基因的缺失和突變率均超過了p53基因的突變率。H19基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色，是繼p53基因之后在腫瘤分子生物學(xué)上又一重大發(fā)現(xiàn)。國內(nèi)外眾多學(xué)者就其與腫瘤的關(guān)系進行了廣泛而深入的研究:Ayesh等［11］發(fā)現(xiàn)H19mRNA能使許多基因表達上調(diào)，而這些基因與腫瘤細胞的侵襲、遷徙和血管形成有密切的關(guān)系;Ariel等［12，13］早期研究發(fā)現(xiàn) H19轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為腫瘤胚胎 RNA，且和AFP一樣可作為肝癌的標(biāo)記物應(yīng)用于臨床;Tanos等［14］研究發(fā)現(xiàn)H19的過表達對食道癌及結(jié)直腸癌細胞的生長很重要;王文玲等［15］研究發(fā)現(xiàn)H19在宮頸癌組織中的表達陽性率明顯高于宮頸上皮內(nèi)瘤變及正常宮頸組織，并且H19的表達與腫瘤的惡性程度及術(shù)后早期復(fù)發(fā)明顯相關(guān)，可作為判斷宮頸癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)的檢測指標(biāo)。H19的印跡異常參與了許多遺傳病及腫瘤的發(fā)生，可能是一種抑制腫瘤浸潤和進展的基因，有可能成為判斷腫瘤浸潤及進展的標(biāo)志物。

3.1 與腎上腺皮質(zhì)腫瘤的關(guān)系 與其他許多腫瘤相比較，腎上腺皮質(zhì)腫瘤似乎減少了H19基因的表達，為了明確H19基因低表達的可能原因，高等研究了正常的腎上腺皮質(zhì)、增生的腎上腺皮質(zhì)、腎上腺皮質(zhì)腺瘤及腎上腺皮質(zhì)癌等組織H19基因的CpG島啟動子區(qū)域甲基化情況。他們發(fā)現(xiàn)在腎上腺皮質(zhì)惡性腫瘤組織中，H19基因的CpG島啟動子區(qū)域甲基化水平較其他組織明顯增加。因此，正常的H19基因的表達可以在正常及增生的腎上腺皮質(zhì)組織中檢測到，然而在腎上腺惡性腫瘤及腺瘤中，他們不僅驚奇地發(fā)現(xiàn)H19基因低表達、同時還發(fā)現(xiàn)IGF2基因高表達［16］。

3.2 與絨毛膜癌的關(guān)系 與腎上腺癌相比較，絨毛膜癌組織中H19基因表達上調(diào)、IGF2基因表達下調(diào)，這種改變的原因在于等位基因的充分甲基化［17］。從人類絨毛膜癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本中亦可以發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致H19基因表達上調(diào)的大量啟動子甲基化的現(xiàn)象。這使得研究者Arima等［17］提出，在絨毛膜癌的情況下，H19基因的啟動子突變，允許它克服了啟動子CpG甲基化的轉(zhuǎn)錄抑制，從而導(dǎo)致H19的表達上調(diào)。

3.3 與肝癌的關(guān)系 在肝癌組織中，H19與IGF2表達的變化通常為單等位基因表達等位基因［18］。在體外實驗中，在缺氧的條件下培養(yǎng)的肝癌細胞株其H19基因的表達上調(diào)。

3.4 與膀胱癌的關(guān)系 膀胱黏膜是胎兒時期H19基因RNA高表達的一種組織［19］。而在膀胱癌，H19基因表達上調(diào)存在于多數(shù)階段［20］。H19基因RNA的存在是一種膀胱癌向侵襲性癌及移行細胞癌快速發(fā)展的重要因素。在膀胱癌中，H19的印跡缺失位點已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。

3.5 與乳腺癌的關(guān)系 除了青春期及孕期的乳腺組織以外，正常腺體組織是不表達H19RNA的。Adriaenssens等［21］研究發(fā)現(xiàn)72.5%的乳腺癌組織的H19基因顯示表達增加，在這些H19表達上調(diào)的乳腺癌組織中有92.9%的基質(zhì)細胞，2.9%的上皮細胞。Berteaux等［22］研究還發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中H19基因的過表達是促進細胞增殖的原因。這些組織中H19的表達與腫瘤抑制蛋白P53及細胞增殖核抗原Ki-67相關(guān)［21］。然而，腫瘤抑制蛋白Rb蛋白及轉(zhuǎn)錄抑制因子E2F6足以抑制H19在乳腺癌組織中的表達［22］。

4 參與的信號通路

在細胞內(nèi)H19RNA的確切作用目前尚不清楚，盡管目前已經(jīng)有許多已知的激活H19轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)及條件，并且已知H19對細胞周期活動及狀態(tài)的影響，但是它是如何發(fā)揮這種作用的機制尚不明了。

4.1 上游效應(yīng)-激素調(diào)節(jié) Adriaenssens［23］在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，H19的高表達與類固醇受體的存在相關(guān)。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，雌激素的主要形式17-β-雌二醇和皮質(zhì)酮能夠單獨刺激子宮內(nèi)膜細胞H19的轉(zhuǎn)錄，而孕激素卻抑制這種效應(yīng)［23］。他莫昔芬是一種雌激素受體競爭結(jié)合劑并經(jīng)常用于治療乳腺癌的化療，17-β-雌二醇能單獨刺激MCF-7細胞的H19的轉(zhuǎn)錄，而增加他莫昔芬后則抑制了H19的轉(zhuǎn)錄，這就表明在H19的轉(zhuǎn)錄過程中有一個假定的激素作用［23］。

4.2 下游的影響-血管生成，代謝，組織浸潤和遷移 一項比較反義轉(zhuǎn)染細胞和轉(zhuǎn)染細胞H19的基因表達之間的差異的實驗，提示以下的基因被上調(diào):uPar，c-src激酶，酪氨酸激酶2絲裂原活化蛋白激酶，酪氨酸激酶 2，c-jun，JNK1，Janus激酶 1，TNF-a，IL6，肝素結(jié)合生長因子樣生長因子，細胞間黏附分子1，NF-κB等［24］。這也表明，血管生成和FGF18可能是H19的轉(zhuǎn)錄RNA的潛在目標(biāo)［18］。由于功能及H19基因的RNA上調(diào)途徑參與的結(jié)果，目前認為H19基因的RNA在腫瘤的發(fā)生過程中起著組織浸潤，轉(zhuǎn)移和血管生成的關(guān)鍵角色［24］。

Lottin等［25］還發(fā)現(xiàn)，H19的表達呈正調(diào)控轉(zhuǎn)錄后硫氧還蛋白。至關(guān)重要的硫氧還蛋白是一種蛋白質(zhì)的減少氧化代謝過程中細胞內(nèi)的反應(yīng)，其往往是高水平存在于過度表達H19基因的RNA的癌組織中。

5 IGF2基因

IGF2基因是第1個被證實的內(nèi)源性印跡基因，F(xiàn)einberg等［26］于1993年在人類中首次發(fā)現(xiàn)了IGF2等印跡基因，并且證實人類的IGF2基因是父系等位基因表達，母系等位基因印跡。IGF2位于人染色體11p15.5，全長8.8 kb，共有 9個外顯子，8個內(nèi)含子，有P1～4個啟動子。IGF2基因編碼的產(chǎn)物胰島素樣生長因子(IGF2)，是一種重要的促胚胎細胞生長因子，也是一種促有絲分裂肽，具有促進細胞有絲分裂、胚胎形成、產(chǎn)后生長發(fā)育等作用，生理條件下對胚胎的正常生長發(fā)育有重要作用，病理條件下能刺激腫瘤細胞的增殖。IGF2可通過自分泌或旁分泌的方式作用于細胞表面的IGF2受體。IGF2受體有Ⅰ型和Ⅱ型兩種，IGF2主要通過Ⅰ型受體介導(dǎo)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)揮作用，Ⅱ型受體介導(dǎo)溶酶體內(nèi)吞噬溶酶體對IGF2的降解使其滅活［27］。目前IGF2被認為是多種腫瘤重要的自分泌生長因子，其過度表達已被證實具有促進細胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化的作用［28］。人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展與IGF2基因印跡調(diào)控異常有關(guān)。近幾年來的大量研究顯示，在肝癌［29］、胃癌［30］、結(jié)腸癌［31］等多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了IGF2印跡丟失的現(xiàn)象，提示IGF2的印跡丟失與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切相關(guān)。

6 在腫瘤治療中的作用

在腫瘤細胞中H19RNA的功能尚不完全清楚，它在腫瘤細胞中存在多種類型表明，它可作為初步診斷，癌癥復(fù)發(fā)和惡性潛在的腫瘤標(biāo)志物而應(yīng)用于臨床［32－34］。

6.1 癌細胞中H19基因啟動子的激活(以及在正常組織中的沉默)是導(dǎo)致基因療法中使用H19的啟動子驅(qū)動癌細胞的細胞毒性基因表達的建議。目前利用基因H19啟動子驅(qū)動細胞毒性基因表達的實驗正在小鼠身上開展［20］。

6.2 由H19基因與DT-A(白喉毒素)構(gòu)成的DTA-H19作為膀胱癌［35］、卵巢癌［36］和胰腺癌［37］的免疫治療方式已經(jīng)進入臨床實驗階段。BC-819或DTA-H19這種質(zhì)粒真正體現(xiàn)了有針對性的治療方法，因為所有的質(zhì)粒進入分裂的細胞，但是只在腫瘤細胞中才能發(fā)現(xiàn)由H19轉(zhuǎn)錄因子存在而導(dǎo)致的DT-A的表達，所以它僅僅破壞腫瘤細胞而不影響正常細胞的功能。

在一項雙中心、以BC-819作為表淺性膀胱癌治療方案的Ⅰ期及Ⅱa期臨床實驗中［38］，有超過70%的患者未發(fā)現(xiàn)嚴重副作用及腫瘤治療反應(yīng)，其中包括仍未采取優(yōu)化治療劑量及方案的患者。

BC-819曾作為表淺性膀胱癌、卵巢癌、轉(zhuǎn)移性肝癌的實驗性治療，曾有一位面臨再次行膀胱全切除術(shù)的膀胱癌患者，在2004年應(yīng)用該項治療后未發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，且無不良反應(yīng)［38］;一位卵巢癌患者應(yīng)用該項治療后血中CA125的數(shù)值下降近50%，腹水中癌細胞亦大量減少;針對轉(zhuǎn)移性肝癌患者，應(yīng)用BC-819直接注射入腫瘤細胞，觀察到有相當(dāng)一部分腫瘤細胞壞死。

雖然在大多數(shù)癌癥類型的H19的表達譜眾所周知，H19RNA在影響癌細胞對藥物治療反應(yīng)的作用仍是未知數(shù)。然而，最近的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了當(dāng)H19 RNA大量存在時，硫氧還蛋白和p95(NCA-90)在腫瘤細胞中表達［38，39］。這種理論可以導(dǎo)致更個性化的癌癥治療方案，例如，在H19過表達的腫瘤細胞中p95的表達可能表明對藥物毒性有較高的耐受性，因此對于H19的過表達(和p95)的個別癌癥患者，治療可能重點為放療或免疫治療，從而代替化療。

綜上所述，針對惡性腫瘤組織中IGF-2及H19印跡狀態(tài)及表達情況的研究，可能會對惡性腫瘤患者的早期診斷及預(yù)后提供一個新的思路。

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