武曉云，劉 琦，郭玉雙，武小霞

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150086；3.貴州省煙草科學(xué)研究所，貴陽 550081；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

胡柚（Citrus changshanensis）原產(chǎn)于浙江省常山縣，是一種重要的地方特色柑橘良種[1]。胡柚果實(shí)色澤艷麗、果型美觀、耐儲(chǔ)藏，并且富含多種維生素和人體必需氨基酸和豐富的柑橘類黃酮物質(zhì)，如柚皮苷（Naringenin）和新桔皮苷（Neohesperidin）等，因此是一種非常值得推廣和扶持的柑橘品種[2]。目前，胡柚已成為我國(guó)主要栽培柑橘品種之一：全國(guó)的種植面積多達(dá)一百多萬畝，栽培種植的省份包括浙江省、江西省、福建省和湖南省、年均產(chǎn)量100多萬t，年產(chǎn)值近20億元。

胡柚黃斑病是胡柚常見病害之一，染病植株葉片較正常植株明顯減少，并且葉片出現(xiàn)黃化癥狀，植株不能結(jié)果或減少，并且果實(shí)出現(xiàn)變小、酸味增加。該病害最早報(bào)道于上世紀(jì)90年代，由于當(dāng)時(shí)條件所限該病害被認(rèn)為由真菌或細(xì)菌引起[3-4]。近年來，該病害的發(fā)生范圍不斷擴(kuò)大，有暴發(fā)流行之趨勢(shì)，該病害已嚴(yán)重影響胡柚的產(chǎn)量和品質(zhì)，可能對(duì)胡柚整個(gè)產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展造成嚴(yán)重影響。但是，該病害的病原至今未能得到系統(tǒng)的鑒定，因此嚴(yán)重影響相應(yīng)防治措施的制定。本文通過血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)，從癥狀表現(xiàn)葉片黃化的胡柚植株中檢出柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV），并對(duì)胡柚上克隆CTV病毒外殼蛋白（CP）基因的序列與GenBank中登陸的相應(yīng)序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明胡柚黃斑病可能由CTV一個(gè)新的分離物引起。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

胡柚葉片采集自浙江省常山縣，癥狀表現(xiàn)為葉片黃化，具體采集信息見表1。

表1 胡柚樣品采集地點(diǎn)、采集時(shí)間及癥狀Table 1 List of sampling locations and time,and symptoms of Huyou

1.2 血清學(xué)檢測(cè)

采用Agdia公司的CTV ELISA Reagent Set試劑盒進(jìn)行DAS-ELISA檢測(cè)，并參照Agdia公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。DAS-ELISA的陽性對(duì)照購自Agdia公司，陰性對(duì)照采用健康胡柚葉片（由常山縣農(nóng)業(yè)局植保植檢站提供）。

1.3RT-PCR擴(kuò)增和克隆

用TRIzol Reagent（Invitrogen公司）提取胡柚葉片的總RNA。根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，設(shè)計(jì)CTV外殼蛋白（CP）基因的通用引物 CP1（5′ATGGACGACGAAA CAAAGA 3′）和 CP3（5′TCAACGTGTGTTGAATTTCC 3′）。用M-MLV試劑盒（Promega公司）根據(jù)試劑盒提供的試驗(yàn)步驟配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液，以CP3為引物合成cDNA第一鏈。以CP1和CP3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)。擴(kuò)增片段用DNA膠回收試劑盒（Axygen公司）進(jìn)行回收后，連接至pGEM-T載體（Promega公司）中，并進(jìn)行測(cè)序測(cè)定。

1.4 序列分析

序列拼接和同源性分析采用DNAman 6.02（Lynnon Biosoft）程序進(jìn)行；應(yīng)用Clustal X 1.83程序進(jìn)行多序列比對(duì)[6]，用MEGA4.0程序中的最大簡(jiǎn)約法（Maximum parsimony，MP）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹的可信度用bootstrap進(jìn)行檢測(cè)（1 000次重復(fù)）[7]。系統(tǒng)進(jìn)化樹中其他CTV分離物及GenBank登錄號(hào)如下：B165（Accession EU076703）、Mexico（DQ272579）、NUagA（AB046398）、NZ-B18（FJ525436）、NZRB-G90（FJ525432）、NZRB-M12（FJ525431）、NZRB-M17（FJ525435）、NZRB-TH28（FJ525433）、NZRB-TH30（FJ525434）、Qaha（AY340974）、SY568（AF001623）、T30（AF260651）、T36（U16304）、T318A（DQ151548）、T385（Y18420）、HA16-5（GQ454870）、P09.18（GQ424346）和 VT（U56902）。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀觀察

對(duì)浙江省主要胡柚種植區(qū)衢州市和常山縣5處胡柚種植株園的胡柚的田間調(diào)查表明，胡柚黃化病的發(fā)病率在2.3%左右。癥狀主要包括植株葉片減少、脈間黃化（見圖1），結(jié)果數(shù)量及質(zhì)量降低，大部分發(fā)病植株的莖部不出現(xiàn)莖點(diǎn)的癥狀，少數(shù)植株具輕微的莖點(diǎn)癥狀。由于發(fā)病植株分布具有分散性和不連續(xù)性，且路邊植株的發(fā)病率較中間高，具有病毒病害的特征。

圖1 胡柚黃化癥狀Fig.1 Yelllowing symptoms of Huyou

2.2DAS-ELISA檢測(cè)

用DAS-ELISA對(duì)采集的18個(gè)植株表現(xiàn)黃化癥狀的胡柚進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明除CS-3、CS-6和QZ-7外，其余15個(gè)樣品與CTV抗血清均有反應(yīng)。其中，CS-7與CTV抗體的反應(yīng)最強(qiáng)（OD值為3.783），約為陽性對(duì)照的3倍，其余樣品與CTV抗體的反應(yīng)較弱（見表2）。表明，胡柚黃化病可能與CTV病毒有關(guān)。為進(jìn)一步明確感染胡柚的CTV株系，我們對(duì)CS-7樣品進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。

2.3RT-PCR擴(kuò)增

用CP3進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，用CP1和CP3進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增的目的條帶約700 bp，與預(yù)期條帶大小一致（見圖2）。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、克隆、測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增至目的片段長(zhǎng)672 bp（GenBank登陸號(hào)：HQ634290）。Blastn同源性搜索結(jié)果表明該片段與CTV P09.18分離物（GQ424346）的CP基因具最高相似性，為97.17%[8]。

表2 胡柚樣品的DAS-ELISA檢測(cè)Table 2 DAS-ELISA detection results of different Huyou samples

圖2 CS-7樣品的RT-PCR檢測(cè)Fig.2 RT-PCR detection of CS-7

2.4 同源性分析

將克隆的CS-7 CP基因與CTV GenBank中的其他CTV分離物的相應(yīng)序列用Clustal X 1.83程序進(jìn)行多序列比對(duì)后進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，在核苷酸水平上，CS-7與P09.18相似性最高（97.0%），其次分別是 NZRB-TH30（96.8%）、NZRB-M17（96.6%）、NZRB-M12（96.5%）、NZRBTH28（96.5%）；在氨基酸水平上，CS-7與P09.18、NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12 和 NZRBTH28的相似性都為96.6%（見表3）。表明CS-7與P09.18、NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12 和NZRB-TH28具有較近的遺傳關(guān)系。

表3 CS-7 major CP的核苷酸及氨基酸序列與CTV不同分離物之間相似性比較Table 3 Similarity between nucleotide and amino acid sequences of major CP of CS-7 and other CTV isolates

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將克隆的CTV CS-7分離物的CP基因與GenBank中的其他CTV分離物的相應(yīng)序列用MEGA 4.0程序構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖3）。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，CS-7與P09.18聚于一小分支后再與NZRB-TH28、NZRB-M17、NZRB-M12 和 NZRBTH30 4個(gè)分離物形成一個(gè)單獨(dú)的分支，進(jìn)一步表明 CS-7 與 P09.18、NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12和NZRB-TH28具有較近的進(jìn)化關(guān)系。

圖3 CS-7與其他CTV分離物構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of CS-7 and other CTV isolates

3 討論

CTV屬于長(zhǎng)線型病毒科（Closteroviridae）長(zhǎng)線型病毒屬（Closterovirus），是世界范圍內(nèi)危害最強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)意義最為重要的柑橘病害之一[9]。該病毒在我國(guó)也普遍發(fā)生，全國(guó)幾乎所有的柑橘種植區(qū)都有該病毒發(fā)生與為害的報(bào)道[10-14]。CTV的寄主范圍僅限于蕓香科植物，研究表明CTV可侵染絕大多數(shù)栽培的柑橘品種。但是，胡柚上至今還未見有CTV分布與為害的報(bào)道。本研究首次從血清學(xué)和分子水平證實(shí)了CTV病毒在胡柚上的存在，表明胡柚也是CTV的寄主之一。

根據(jù)對(duì)寄主植物造成的癥狀，CTV可粗分為4個(gè)株系：莖陷點(diǎn)株系（Stem-pitting，SP）、衰退株系（Decline inducing，DI）、苗黃化株系（Seedling yellows，SY）和弱癥狀株系[9，15]。其中 SP 株系以分離物VT為代表，DI株系以T30為代表，SY株系以T36為代表。王洪祥等對(duì)浙江省黃巖的“本地早”（Citrus succosa）密柑上的CTV進(jìn)行了研究[16]，結(jié)果表明CTV在“本地早”發(fā)生相當(dāng)普遍，株莖陷點(diǎn)株系、衰退株系和苗黃化株系都有存在，并且發(fā)現(xiàn)苗黃株系或強(qiáng)莖陷點(diǎn)株系和碎葉病毒存在復(fù)合感染，這是造成黃巖本地早和新本1號(hào)產(chǎn)量低下的一個(gè)重要原因。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中本文分離的CTV株系（CS-7）與上述株系都有較遠(yuǎn)的遺傳距離，而與P09.18、NZRB-TH28、NZRB-M17、NZRB-M12 和NZRB-TH30聚于一分支，表明CS-7可能是CTV一個(gè)新的可誘導(dǎo)胡柚植株黃化癥狀的株系。CTV P09.18分離自美國(guó)的California，而NZRB-TH30、NZRB-M17、NZRB-M12和NZRB-TH28來自于新西蘭。由于柑橘起源于我國(guó)及東南亞等地區(qū)，因此P09.18和NZRB-TH30等美國(guó)和新西蘭的CTV可能通過柑橘及其種苗等的貿(mào)易被傳入。

在血清學(xué)檢測(cè)中，不同的分離物與抗血清有著不同的反應(yīng)，表明侵染胡柚的CTV可能也由不同的株系存在，并且可能存在復(fù)合侵染現(xiàn)象。因此，有必要擴(kuò)大樣品采集范圍，對(duì)胡柚上CTV的株系組成以及為害進(jìn)行更系統(tǒng)的研究，為胡柚黃斑病的防治提供理論基礎(chǔ)。雖然，我們從植株表現(xiàn)黃化的胡柚中檢測(cè)到了CTV病毒，但是胡柚植株黃化癥狀是否由CTV引起，還有待將該分離物接種至健康胡柚幼苗并完成柯赫氏法則鑒定，但是這最少需要1～2年的時(shí)間才可能有結(jié)果。

*武小霞為本文的同等貢獻(xiàn)者。

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