周瑞金，杜國強，師校欣

（1.河南科技學院園林學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河北農業(yè)大學園藝學院，河北 保定 071001）

利用轉基因進行作物改良開辟了作物育種的新途徑，最大限度地繞過了物種間生殖隔離的障礙，使農作物獲取整個生物界的遺傳資源，大大縮短了育種的周期，但其能否成功關鍵在于外源基因在轉化體內的遺傳穩(wěn)定性和表達情況。

轉基因應用的實踐表明，外源基因在受體中的命運受到一系列生理生化過程的作用，并以復雜的遺傳方式表現(xiàn)出來，外源基因片段大小、甲基化、丟失、共抑制、基因沉默等都會影響其穩(wěn)定遺傳和表達[1－3]。

在植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)材料繼代時間越長遺傳變異率越高。經過多代培養(yǎng)的轉基因組培苗是否仍然保持原有品種的遺傳性狀，外源基因是否丟失，關系到轉基因苗離體保存是否安全的問題。前人研究主要集中于普通組培苗繼代培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性[4－9]，對于轉基因組培苗在繼代培養(yǎng)過程中外源基因的穩(wěn)定性研究較少。本試驗對繼代多代的轉基因蘋果組培苗中目的基因和報告基因的遺傳和表達情況進行研究，為轉基因作物離體的保存和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為蘋果（Malus domestica Borkh.）組培苗及轉豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（CpTI）蘋果組培苗，品種為皇家嘎拉（Royal Gala）、王林（Orin）、喬納金（Jonagold）和富士（Fuji），由河北農業(yè)大學園藝學院生物技術實驗室培育。其中轉基因品種皇家嘎拉46個株系編號為1～46；王林9個株系編號為47～55；喬納金3個株系編號為56～58；富士2個株系編號為59～60。非轉基因品種有：嘎拉（CK1）；王林（CK2）；喬納金（CK3）；富士（CK4）。

轉基因蘋果組培苗采用常溫繼代保存。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，光照時間16 h光照∶8 h黑暗，光照強度1 500～2 000 lx。繼代培養(yǎng)基 MS+BA 0.5 mg·L－1+NAA 0.04 mg·L－1+白砂糖 30 g·L－1+瓊脂 6.0 g·L－1，pH 5.8～6.0。每 8 周繼代一次，培養(yǎng)保存6～8年。

1.2 方法

1.2.1 nptⅡ基因的檢測

取常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年的轉CpTI基因蘋果株系組培苗新梢，接入繼代培養(yǎng)基MS+BA 0.5 mg·L－1+NAA 0.04 mg·L－1+白砂糖 30 g·L－1+瓊脂 6.0 g·L－1+Kan50mg·L－1中，30d后觀察新梢生長和白化情況。

1.2.2 外源CpTI基因的PCR檢測

參照杜國強等提取蘋果組培苗DNA的方法提取植物總DNA[10]，堿裂解法提取農桿菌質粒DNA[11]。PCR擴增分別以被檢植物總DNA、陰性對照植物總DNA、陽性對照（質粒）DNA為模板進行PCR擴增反應。由CpTI基因序列設計引物1：5′GATGATGGTGCTAAAGGTGT 3′，引物 2：5′CTTACTCATCATCTTCATCC 3′。PCR 反應體系：20 μL 體系中含 TaqDNA 聚合酶 1.5 U，dNTPs 0.3 mmol·L－1，上游引物和下游引物各 0.25 μmol·L－1，Mg2+2.25 mmol·L－1，模板 DNA 40 ng，1×PCR 緩沖液，加滅菌超純水使總體積為20 μL。

PCR擴增程序為：在94℃預變性6 min后，擴增35次循環(huán)，每循環(huán)包括94℃變性60 s，56℃退火90 s，72℃延伸90 s，最后一循環(huán)后72℃延伸10 min。擴增反應后，取各樣品反應液5 μL，用1%的瓊脂糖在100 V·cm－1條件下電泳檢測，GD8000凝膠成像系統(tǒng)觀測結果并照相。

1.2.3 總RNA提取

蘋果組培苗總RNA提取用TRIzol一步法（大連TaKaRa公司），按試劑操作說明書進行。

1.2.4 mRNA反轉錄

按照Promega公司AMV mRNA逆轉錄試劑盒操作說明書進行。

1.2.5 RT－PCR 分析

PCR 反應體系：25 μL 反應體系：3 μL 20×稀釋的逆轉錄產物，1 μL 引物 1，1 μL 引物 2，2 μL 25 mmol·L－1dNTPs，1.5 μL 25 mmol·L－1Mg2+，5 U TaqDNA聚合酶，2.5 μL 10×PCR緩沖液。PCR擴增條件：在94℃預變性2 min后，擴增30次循環(huán)，每循環(huán)包括94℃變性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸100 s，最后一循環(huán)后72℃延伸10 min，4℃保溫。擴增產物5 μL，用1%的瓊脂糖在100 V·cm－1條件下電泳檢測，GD8000凝膠成像系統(tǒng)觀測結果并照相。

2 結果與分析

2.1 nptⅡ基因的卡那霉素抗性檢測

nptⅡ標記基因可使轉化植株產生對卡那霉素的抗性。蘋果組培苗新梢在含有50 mg·L－1卡那霉素的繼代培養(yǎng)基中生長30 d后，未轉基因的對照組培苗葉片全部白化，轉基因嘎拉、富士及喬納金組培苗全部生長正常，未出現(xiàn)白化或花葉現(xiàn)象，而轉基因王林中除轉化株系48和49表現(xiàn)出新生葉片花葉現(xiàn)象外，其他株系生長正常（見圖1）。說明標記基因nptⅡ在嘎拉、富士和喬納金常規(guī)繼代培養(yǎng)的轉化株系中穩(wěn)定存在并可以正常表達；而王林2個轉化株系出現(xiàn)的花葉現(xiàn)象可能是因為nptⅡ酶表達量偏低所致。

2.2 外源CpTI基因的PCR檢測

采集繼代培養(yǎng)6～8年的轉基因蘋果組培苗的60個株系葉片，測定外源CpTI基因的存在情況。以CpTI基因的一對特異引物進行擴增，從60個株系中均可以得到一條均一的條帶，片斷大小約309 bp，而以非轉基因蘋果組培苗總DNA為模板擴增，沒有檢測到該特征帶。

因此認為轉基因蘋果在組織培養(yǎng)條件下，常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年后，外源CpTI基因在轉基因植株中具有較強的穩(wěn)定性。

2.3 RT-PCR檢測外源基因在蘋果組培苗中的表達

對外源CpTI基因在60個株系蘋果組培苗中的表達進行RT－PCR檢測，結果如下：48和49號2個株系沒有得到309 bp的特異性目的片段，42～47、52、55～59等15個株系得到的309 bp特異性目的片段亮度暗，其余43個株系得到的目的片段明亮。表明外源CpTI基因在2個株系中mRNA未表達，43個轉化株系中的mRNA水平表達強度較高，在其余轉化株系中表達強度較弱。部分株系的蘋果組培苗總RNA及RT－PCR電泳檢測結果如圖2、3所示。

圖1 轉基因蘋果苗在含50 mg·L-1卡那霉素培養(yǎng)基上的生長情況Fig.1 Plant growth status of transgenic apple on medium containing 50 mg·L-1Kan

圖2 部分蘋果組培苗總RNA電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of total RNA in apple cultured in vitro

圖3 部分蘋果組培苗RT-PCR電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR in apple cultured in vitro

3 討論

果樹的遺傳背景十分復雜，其體細胞突變不僅發(fā)生在田間狀態(tài)，也廣泛存在于組織與細胞培養(yǎng)中。一般認為變異頻率為1%～3%[12]，但也有表型變異率高達90%的報道[5]。這種變異的發(fā)生對于保存含有外源目的基因的轉化株系十分不利，可能會導致目的基因的沉默或丟失。前人研究表明，果樹組培苗遺傳穩(wěn)定性受基因型、繼代培養(yǎng)時期（繼代次數(shù)）、培養(yǎng)條件如生長調節(jié)劑的應用等因素影響，如香蕉莖尖快繁后代存在一定比例的表現(xiàn)型變異，變異率隨繼代代數(shù)增加而增加，而杜國強等曾對不同繼代次數(shù)（3～90代）的富士、金冠和喬納金組培苗進行分析，認為其莖尖離體繼代培養(yǎng)90次以內具有較高的遺傳穩(wěn)定性[7]。本試驗對常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年的60個蘋果轉化株系外源基因的檢測結果表明，外源基因在蘋果轉化組培苗中具有較強的穩(wěn)定性。

在許多情況下，外源基因在受體植株中的表達很不穩(wěn)定，有的能正常表達，有的表達量很低甚至不表達，其表達與轉基因的失活和沉默有關。在矮牽牛轉苯基苯乙烯酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）基因轉化紫花矮牽牛以加深花色的研究中發(fā)現(xiàn)，高達42%的轉基因當代植株產生白色或紫白相間的花朵，說明轉基因和內源基因均被抑制，即基因不但沒有高效表達，反而影響了內源基因的正常表達。在同一植物轉化事件中，發(fā)生外源基因沉默的轉化體占總數(shù)的3%～100%是一個較為普遍的現(xiàn)象[13]。本試驗在卡那霉素抗性檢測中有2個株系表現(xiàn)花葉，結合mRNA檢測結果分析，造成這種現(xiàn)象的原因可能是因為外源基因或nptⅡ酶表達量偏低所致。而外源基因表達差異的原因可能是由于外源基因整合位點不同、基因沉默或基因的甲基化等，關于外源基因在不同株系間表達的機理還有待進一步研究。

4 結論

在60個常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年的轉CpTI基因蘋果轉化株系中均可檢測出CpTI特異基因片段；除轉化株系48和49在50 mg·L-1卡那霉素濃度下出現(xiàn)花葉現(xiàn)象，表現(xiàn)缺乏卡那霉素抗性外，其他株系在含相同濃度卡那霉素的培養(yǎng)基中生長正常。對60個轉化株系蘋果組培苗進行RT-PCR檢測，轉入的外源CpTI基因在43個轉化株系中得到了較高水平的表達，分別為轉化株系1～41、51和53；在42～47、52、55～59等15個轉化株系中表達強度低，在轉化株系48和49中未檢測到特異表達條帶。因此，轉基因蘋果在組織培養(yǎng)條件下，常規(guī)繼代培養(yǎng)6～8年后，外源CpTI基因在轉基因植株中可穩(wěn)定存在，但外源基因表達不穩(wěn)定，在不同株系間存在一定差異。

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