張丙秀，李 璐，楊國(guó)慧，高慶玉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

多倍體育種可以高效改變果樹(shù)某些性狀，從而達(dá)到提高產(chǎn)量、改良品質(zhì)、增強(qiáng)抗逆性的目標(biāo)[1－2]。自Blakeslee等用秋水仙素誘導(dǎo)曼陀羅四倍體成功后[3]，許多科技工作者開(kāi)展了果樹(shù)多倍體誘導(dǎo)工作。早在20世紀(jì)50年代，Dermen通過(guò)誘導(dǎo)獲得了葡萄四倍體或嵌合體[4]。日本在葡萄多倍體誘導(dǎo)研究方面成效最為顯著[5]。四倍體葡萄因早熟、大粒、品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)深受市場(chǎng)的歡迎，但目前我國(guó)四倍體品種數(shù)量較少，遺傳背景狹窄[6]，因此，葡萄四倍體誘導(dǎo)研究對(duì)葡萄育種和生產(chǎn)都具有重要意義。

過(guò)去普遍采用浸種和滴涂生長(zhǎng)點(diǎn)的方法誘導(dǎo)果樹(shù)多倍體，但這種在整體水平上誘導(dǎo)染色體加倍的方法受環(huán)境干擾大，嵌合體多，組培技術(shù)使誘導(dǎo)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)染色體加倍成為可能[7－8]。而且，秋水仙素處理組培苗可以使獲得的誘變嵌合體在短時(shí)間內(nèi)快速大量繼代和分離[9]。因此，組培技術(shù)誘導(dǎo)多倍體的方法日益受到關(guān)注。在多倍體鑒定上，過(guò)去多通過(guò)形態(tài)和器官組織進(jìn)行間接鑒定或體細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)法在顯微鏡下觀察鑒定[10]，前者簡(jiǎn)便，但可靠性低[11]，后者可靠性高，但操作復(fù)雜，難度較大[12]。利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行多倍體檢測(cè)，省時(shí)且操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和靈敏度極高[13－14]。京秀葡萄是加工鮮食兼用的優(yōu)良品種，關(guān)于京秀多倍體組織培養(yǎng)誘變方法的研究，也有相關(guān)報(bào)道[6,15]，但誘變率不夠理想。

本試驗(yàn)以秋水仙素為誘變劑，對(duì)京秀葡萄進(jìn)行組培誘導(dǎo)，探索秋水仙素不同濃度以及不同處理方法對(duì)誘變?nèi)旧w變異的影響，利用流式細(xì)胞倍性分析儀對(duì)誘變多倍體整株進(jìn)行分析鑒定。以期獲得京秀四倍體植株，為葡萄多倍體育種提供種質(zhì)資源，并為四倍體的誘變尋找簡(jiǎn)單有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

葡萄品種京秀，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)教研室高慶玉教授提供。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

采用MS培養(yǎng)基，添加0.6%的瓊脂粉、2.5%的蔗糖。pH調(diào)至5.5，121℃高壓滅菌15 min。激素和秋水仙素在滅菌前加入。在溫度為（25±2）℃、光照強(qiáng)度為2 000 lx、日照時(shí)間12 h的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 浸泡單芽莖段法誘導(dǎo)四倍體

將無(wú)菌組培苗的帶單芽莖段浸泡在各濃度（0.05%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%）的秋水仙素中，包好瓶口，避免強(qiáng)烈光照，分別處理6、12、24、48和72 h。處理過(guò)程中輕輕搖動(dòng)以使誘導(dǎo)材料與藥液充分接觸，以無(wú)菌水為對(duì)照，處理后接種到培養(yǎng)基（MS+2.5 mg·L－16－BA+0.1 mg·L－1IBA）上培養(yǎng)。待腋芽萌發(fā)后取部分芽尖進(jìn)行倍性鑒定，生根誘導(dǎo)（1/2MS+0.5 mg·L－1IBA）20 d 后取根尖進(jìn)行倍性鑒定，研究植株倍性變化。培養(yǎng)30 d后對(duì)組培苗的生長(zhǎng)量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 混培法誘導(dǎo)四倍體

將一定量秋水仙素水溶液加入MS培養(yǎng)基中，配成 50、100、500、1 000、2 000 mg·L－1的秋水仙素培養(yǎng)基，高壓滅菌。選取苗齡12～15 d左右，根系長(zhǎng)為1.5 cm的健壯組培苗，留頂端部分，帶根轉(zhuǎn)入尚未完全凝固的秋水仙素培養(yǎng)基中，每個(gè)處理10株，重復(fù)3次，分別處理15、30、40 d后，剪取芽尖進(jìn)行倍性檢測(cè)，并繼代培養(yǎng)進(jìn)行倍性鑒定。

1.2.3 倍性檢測(cè)

使用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACSAria型流式細(xì)胞分析系統(tǒng)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞核的DNA含量，通過(guò)倍性分析儀對(duì)植株進(jìn)行倍性檢測(cè)。對(duì)誘導(dǎo)后的植株進(jìn)行倍性分析，以未經(jīng)處理的京秀二倍體為對(duì)照。具體方法如下：取生長(zhǎng)良好的組培苗的根尖50 mg或莖尖30 mg，在滴有1 mL提取緩沖液（含有15 mmol·L－1Tris－HCl（pH 7.5），80 mmol·L－1KCl，20 mmol·L－1NaCl，20 mmol·L－1EDTA－Na2，15 mmol·L－1巰基乙醇，0.05%（V/V）Triton X－100）的培養(yǎng)皿中用鋒利刀片迅速切碎，260目尼龍網(wǎng)包住移液槍頭過(guò)濾吸取，再通過(guò)400目細(xì)胞篩過(guò)濾，濾液用標(biāo)準(zhǔn)試管收集，暗處放置3 h，加入0.5 mL Rnase A溶液（100 mg Rnase A 溶于 10 mL 的 10 mmol·L－1Tris－HCl（pH 7.5）、15 mmol·L－1NaCl中，100 ℃煮沸15 min，冰浴冷卻，－20℃保存），置暗處，37℃培養(yǎng)30 min，冰浴冷卻再加入 10 μg·mL－1碘化丙錠0.6 mL，隨即上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)前京秀的葡萄倍性檢測(cè)

取生長(zhǎng)良好的京秀組培苗，取其根尖50 mg及莖尖30 mg，分別提取并過(guò)濾，按1.2.3的方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的結(jié)果為二倍體，如圖1所示。

2.2 浸泡單芽莖段法對(duì)植株生長(zhǎng)情況及四倍體誘變效果的影響

在生長(zhǎng)過(guò)程中，京秀組培苗莖段生長(zhǎng)分化受到抑制，對(duì)組培苗生長(zhǎng)30 d后的生長(zhǎng)量進(jìn)行測(cè)定，如圖2所示，秋水仙素對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用隨濃度增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。秋水仙素濃度為0.05%時(shí)，不同時(shí)間處理間植株生長(zhǎng)量差異不顯著。0.2%和0.3%濃度下，浸泡12和24 h處理的試管苗株高顯著低于浸泡6 h處理的株高。而在對(duì)莖段浸泡時(shí)間相同條件下，0.1%和0.2%濃度處理間的植株生長(zhǎng)量不存在顯著差異。0.4%濃度處理，在24～72 h間植株生長(zhǎng)都受到嚴(yán)重的抑制，根系變短變粗，且根系的分支數(shù)量變多，幾乎不生長(zhǎng)。

圖1 京秀莖尖及根尖DNA含量分布Fig.1 Distribution of DNA content in stem tip and root tip of Jingxiu

圖2 秋水仙素浸泡單芽莖段法的植株生長(zhǎng)Fig.2 Plant growth of shoot segments pretreated by colchicines soaking

從表1中可以看出，0.05%濃度下處理6 h成苗率最高，隨著秋水仙素濃度及處理時(shí)間的增長(zhǎng)，成苗率在總體上呈下降趨勢(shì)。同一時(shí)間處理下，褐化率隨著秋水仙素濃度的增大變化最慢的是6 h處理，最快的是72h處理，成苗率下降最慢的也是6h處理，但最快的卻是48 h處理。同一濃度處理下，隨著處理時(shí)間增長(zhǎng)，低濃度處理的成苗率的下降速度及褐化率的升高速度要都低于高濃度處理。而且，0.4%濃度與其他處理濃度相比，在所有時(shí)間處理下，其成苗率始終最低，褐化率也始終最高。可見(jiàn)高濃度的秋水仙素毒害作用重于長(zhǎng)時(shí)間的浸泡處理。

表1 秋水仙素濃度和處理時(shí)間對(duì)京秀誘變效果及生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of pretreatments with colchicines on induction and growth of Jingxiu

續(xù)表

浸泡莖段誘導(dǎo)京秀葡萄共出現(xiàn)39株變異植株，有17株為四倍體。由表1可知，6 h處理和0.05%的低濃度處理均沒(méi)有出現(xiàn)變異植株。當(dāng)處理時(shí)間在6 h以上時(shí)，誘變率隨著濃度的增加先升高后下降，處理時(shí)間越長(zhǎng)，最佳處理濃度越低，當(dāng)高于此濃度時(shí)，誘變率開(kāi)始下降；處理濃度高于0.05%時(shí),誘變率隨著處理時(shí)間的增加先升高后下降，處理濃度越高，最佳處理時(shí)間越短，當(dāng)超過(guò)此時(shí)間時(shí)，誘變率開(kāi)始下降。在本試驗(yàn)中，最佳濃度及時(shí)間組合為0.3%濃度處理24 h，四倍體的變異率為10.34%。

2.3 混培法對(duì)植株生長(zhǎng)情況及誘導(dǎo)效果的影響

在含秋水仙素的培養(yǎng)基未完全凝固時(shí)，將根系生長(zhǎng)良好的組培幼苗接入。

培養(yǎng)15、30、45 d后觀察發(fā)現(xiàn)：組培苗根的生長(zhǎng)普遍受到抑制，植株生長(zhǎng)變慢，葉片變深綠，腋芽很難萌發(fā)，濃度越高，抑制作用越強(qiáng)；尤其是苗齡較小的植株，不僅嫩芽停止生長(zhǎng)，而且整個(gè)植株都逐漸枯死；有些成活的植株除了生長(zhǎng)緩慢外，新發(fā)葉片變皺，葉緣下卷，繼代后變大變厚，顏色為深綠色，莖和根略粗。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 秋水仙素混培法植株生長(zhǎng)情況Fig.3 Plant growth state of plant on mixed culture with colchicines

從表2可以看出，500 mg·L-1濃度下15 d處理的成苗率最高。本混培處理試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處理時(shí)間對(duì)組培苗生長(zhǎng)的作用強(qiáng)于處理濃度，這體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：其一，同濃度下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，死亡率、褐化率升高明顯，萌芽率下降也顯著，而同時(shí)間處理下，隨著秋水仙素濃度的增加，萌芽率、褐化及死亡率的變化規(guī)律雖同前者，但變化速度緩慢，而且15 d處理萌芽率還出現(xiàn)了先升再降的趨勢(shì)。其二，長(zhǎng)時(shí)間（30和40 d）處理即使在低濃度（50 mg·L-1）下，其萌芽率還是顯著低于短時(shí)間（15 d）中濃度（100～1 000 mg·L-1）處理的萌芽率。

混培法誘導(dǎo)京秀葡萄共出現(xiàn)9株變異植株，有5株為四倍體。從表2中可以得出，短時(shí)間處理時(shí)各濃度均不能誘導(dǎo)變異，而長(zhǎng)時(shí)間高濃度處理會(huì)使苗成活率受到很大影響。組培苗在培養(yǎng)15 d時(shí)，各濃度均未出現(xiàn)變異植株；培養(yǎng)30 d時(shí)，除濃度50 mg·L-1外，各個(gè)濃度都測(cè)得變異植株，1 000 mg·L-1出現(xiàn) 1株四倍體，2 000 mg·L-1出現(xiàn) 2株四倍體；培養(yǎng)45 d時(shí)，由于長(zhǎng)時(shí)間秋水仙素培養(yǎng)對(duì)植株根系抑制作用的增強(qiáng)，變異植株只在100mg·L-1出現(xiàn)1株、500 mg·L-1出現(xiàn)1株，但都為四倍體，且生長(zhǎng)正常。在本試驗(yàn)中，30 d、2 000 mg·L-1的處理效果最好，該處理誘導(dǎo)出變異植株的嵌合體率為0，四倍體出現(xiàn)率為20.00%，占總四倍體植株數(shù)的40%。

表2 秋水仙素混培法對(duì)京秀誘變效果及生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of mixed culture with colchicines on induced polyploidy and growth of Jingxiu

2.4 誘變植株的倍性鑒定

圖4為京秀的四倍體、二、四倍嵌合體和二倍體的DNA含量分布圖。

四倍體植株在接近100的位置上出現(xiàn)一個(gè)單峰；二、四倍嵌合體具有2個(gè)峰：除50附近的位置有1個(gè)峰外，在位于其DNA含量一倍的地方還有一個(gè)峰；二倍體對(duì)照植株僅在熒光強(qiáng)度值為50的位置上出現(xiàn)一個(gè)單峰。經(jīng)FACSAria型流式細(xì)胞儀中軟件分析，得到嵌合體中不同倍性細(xì)胞的相對(duì)比例。

如圖5京秀嵌合體圖譜所示，二倍體細(xì)胞所占比例為47.13%，四倍體細(xì)胞所占比例為52.87%，該結(jié)果也以峰面積形式體現(xiàn)出來(lái)，以此結(jié)果可以了解誘變株中不同細(xì)胞的情況。

圖4 京秀DNA含量分布Fig.4 Distribution of Jingxiu DNA content

3 討論

馬愛(ài)紅等采用500、1 000、2 000 mg·L-1秋水仙素混合培養(yǎng)組培苗至30 d，未發(fā)現(xiàn)加倍植株，也沒(méi)有測(cè)得嵌合體植株，培養(yǎng)40 d時(shí)，僅有4株植株的莖尖嫩葉有加倍現(xiàn)象[6]。但在本研究中，混培法的最佳誘導(dǎo)條件為2 000 mg·L-1培養(yǎng)30 d，四倍體誘導(dǎo)率為20%，與馬愛(ài)紅等研究的結(jié)果有差異，這可能是由于芽的狀況或處理時(shí)的環(huán)境差異造成的。徐德平等研究認(rèn)為，秋水仙素溶液浸泡莖段比秋水仙素混合培養(yǎng)基法誘導(dǎo)葡萄多倍體效果更好[16]，本研究認(rèn)為浸泡莖段法的四倍體誘導(dǎo)率并不明顯高于混合培養(yǎng)基法。但從試驗(yàn)操作和后期生長(zhǎng)等情況看，直接浸泡單芽莖段法簡(jiǎn)單且用藥量少，藥液更易滲入植物組織，倍性特征在短期內(nèi)就能顯現(xiàn)，有利于早期檢測(cè)及培養(yǎng)四倍體植株。另外，秋水仙素混入培養(yǎng)基誘導(dǎo)四倍體時(shí)，如果選用的組培苗苗齡較大則不易誘變，而如果較小，根比較幼嫩，很容易變黑死亡，從而導(dǎo)致整株植株停止生長(zhǎng)甚至死亡。

4 結(jié)論

用秋水仙素對(duì)二倍體葡萄京秀進(jìn)行組培誘導(dǎo)多倍體，并采用流式分析儀對(duì)誘變植株的細(xì)胞DNA含量進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，不同的誘變方法對(duì)于處理時(shí)間和處理濃度的反應(yīng)不同，對(duì)于浸泡單芽莖段法，處理濃度的影響強(qiáng)于處理時(shí)間，而對(duì)于混培法，處理時(shí)間的影響強(qiáng)于處理濃度；浸泡單芽莖段法最佳誘導(dǎo)條件為0.3%處理24 d；混培法的最佳誘導(dǎo)條件為2 000 mg L-1處理30 d；在本研究中，莖段浸泡秋水仙素法誘導(dǎo)葡萄四倍體的效果并不明顯優(yōu)于混培法。

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