張 璐，范杰平，曹 婧，孔 濤，童 聲

(南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031)

響應(yīng)面法優(yōu)化枳實(shí)中辛弗林的超聲輔助提取工藝

張 璐，范杰平*，曹 婧，孔 濤，童 聲

(南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330031)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助提取枳實(shí)中生物堿辛弗林的工藝進(jìn)行優(yōu)化，預(yù)測(cè)得到最實(shí)驗(yàn)佳條件。結(jié)果表明：超聲波法提取枳實(shí)中生物堿辛弗林的最佳工藝條件為枳實(shí)顆粒度30目、乙醇體積分?jǐn)?shù)67.90%、液固比12∶1(mL/g)、提取時(shí)間16min、超聲功率420W，在此條件下，辛弗林的提取量達(dá)到5.87mg/g。該工藝提取結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值5.77mg/g基本吻合，說(shuō)明該優(yōu)化方法可行。

枳實(shí)；辛弗林；超聲提取；響應(yīng)面法

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)或甜橙的干燥幼果。主要含揮發(fā)油、辛弗林、N-甲基酪胺、橙皮甙、VC及VD等。始載于神農(nóng)本草經(jīng)，具有破氣消積，化痰散痞之功效。辛弗林是積實(shí)中的一種生物堿，是枳實(shí)中起主要藥理作用的有效成分，具有收縮血管、升高血壓和較強(qiáng)的擴(kuò)張氣管、支氣管的作用，能夠提高新陳代謝、增加熱量消耗、提高能量水平、氧化脂肪，并能緩解因肥胖引起的輕度和中度抑郁癥狀[1-3]。因此辛弗林廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飲料等保健行業(yè)。

由于該天然產(chǎn)物含量較低，而傳統(tǒng)的提取工藝如煎煮法、熱回流法等則有耗時(shí)長(zhǎng)、提取率低等不足，所以應(yīng)考慮采用一些新的物理輔助提取手段[4]。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助方法對(duì)枳實(shí)中辛弗林的提取工藝進(jìn)行研究，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法[5-9]對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為選擇和制訂枳實(shí)中辛弗林的提取工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枳實(shí)(生品)產(chǎn)自江西。

辛弗林標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.66%) 陜西森弗生物技術(shù)有限公司；甲醇(色譜純)、無(wú)水乙醇(分析純) 天津大茂化學(xué)試劑廠。

1100高效液相色譜儀(配有四元泵及自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器) 美國(guó)安捷倫公司；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器(超聲頻率40kHz、超聲最大功率600W、功率可調(diào)40%～100%、加熱最大功率800W、溫度可調(diào)10～80℃) 昆山市超聲儀器有限公司；FZ-102微型植物粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；KDC-160HR型離心機(jī)科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；FA2104型電子天平 上海倫捷機(jī)電儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枳實(shí)中生物堿辛弗林的提取

枳實(shí)經(jīng)粉碎，篩分，烘干，備用。精密稱(chēng)取枳實(shí)樣品0.5g，采用超聲輔助提取法，用乙醇溶液提取枳實(shí)中生物堿辛弗林，將提取液用高速離心機(jī)離心20min。取上清液1mL，用甲醇定容至10mL，經(jīng)高效液相色譜儀分析檢測(cè)，進(jìn)樣前樣品通過(guò)0.45μm的濾膜過(guò)濾。結(jié)果以提取率Y表示。

式中：C表示提取液辛弗林的質(zhì)量濃度/(g/mL)；V表示加入溶劑的體積/mL；m為枳實(shí)的質(zhì)量/g。

1.2.2 色譜條件

根據(jù)文獻(xiàn)[10-12]條件，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，測(cè)定辛弗林的高效液體色譜條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇∶緩沖鹽溶液(0.02% H3PO4、0.1%十二烷基硫酸鈉、0.02%三乙胺)= 60∶40，柱溫30℃，流速0.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)224nm。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

精密稱(chēng)取辛弗林6mg，置10mL容量瓶中，加無(wú)水甲醇至刻度作為對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣0.2、0.5、1.0、2.0、3.0μL，測(cè)定其峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，辛弗林的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=591.36057χ-16.0981(R2=0.9999)，式中，y為辛弗林峰面積/(mAU·s)、χ為進(jìn)樣量/μg。結(jié)果表明辛弗林在0.12～1.8μg范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 粒度對(duì)提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時(shí)間15min、液固比12∶1 (mL/g)、功率480W的條件下考察枳實(shí)粒度(20～60目)對(duì)提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，當(dāng)粒徑為20目時(shí)辛弗林提取率最低，而當(dāng)粒徑為30目時(shí)提取率達(dá)到最高，隨之，提取率隨著粒徑減小而下降。這是由于當(dāng)粒徑過(guò)大時(shí)，顆粒與溶劑之間的有效接觸不好，從而影響提取效率；而當(dāng)顆粒體積過(guò)小時(shí)，會(huì)有過(guò)多雜質(zhì)溶出且顆粒容易成團(tuán)，這將導(dǎo)致提取率下降。因此30目被選為最佳的粒徑大小。

圖1 粒度對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of material particle size on extraction yield of synephrine

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

在枳實(shí)粒度30目、提取時(shí)間15min、液固比12∶1、功率480W的條件下考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(35%～95%)對(duì)提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of synephrine

由圖2可知，辛弗林產(chǎn)量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而提高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)，提取率達(dá)到最高，之后提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)降低而下降。根據(jù)相似相溶原理，極性相似可以達(dá)到最大溶出度，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)，其極性與辛弗林相似，因此65%乙醇為最佳提取溶劑。

2.1.3 液固比對(duì)提取率的影響

圖3 液固比對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction yield of synephrine

在枳實(shí)粒度30目、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時(shí)間15min、功率480W的條件下，考察液固比6∶1～14∶1(mL/g)對(duì)提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

如圖3所示，辛弗林提取率隨著液固比的增大而提高，當(dāng)液固比為12∶1時(shí)提取率達(dá)到最大，之后提取率隨其增大而減小。這是由于過(guò)多的溶劑使得超聲波對(duì)枳實(shí)的穿透作用減小，從而導(dǎo)致提取率下降。因此，12∶1被選為最佳的液固比。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

在枳實(shí)粒度30目、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、液固比12∶1、功率480W的條件下，考察提取時(shí)間(5～25min)對(duì)提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of synephrine

由圖4可知，辛弗林提取率隨著提取時(shí)間的增加而增加，而當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)15min后，辛弗林提取率的變化已經(jīng)很小。因此，從節(jié)省時(shí)間和能耗的角度考慮，選擇15min為最佳提取時(shí)間。

2.1.5 超聲功率對(duì)提取率的影響

在枳實(shí)粒度30目、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取時(shí)間15min、液固比12∶1的條件下，考察超聲功率(300～540W)對(duì)提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲功率對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasound power on extraction yield of synephrine

由圖5可知，辛弗林提取率隨超聲功率的增大而提高，當(dāng)超聲功率為420W時(shí)提取率達(dá)到最大，之后提取率隨之增大而下降。隨著超聲功率增大，分子擴(kuò)散速度越大，提取率增大，而當(dāng)功率過(guò)大時(shí)，可能一些糖類(lèi)和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)也會(huì)溶出，辛弗林被吸附在固體基質(zhì)上而不易被提取，從而導(dǎo)致提取率下降。因此，420W被選為最佳超聲功率。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化枳實(shí)有效成分辛弗林提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、枳實(shí)粒度(X2)、提取時(shí)間(X3)為3個(gè)對(duì)枳實(shí)辛弗林提取率影響較大的因素。因此根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取這3個(gè)因素對(duì)提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，以?xún)?yōu)化超聲輔助提取枳實(shí)有效成分辛弗林的工藝條件，其具體試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 枳實(shí)有效成分辛弗林提取響應(yīng)面分析方案及計(jì)算分析結(jié)果Table 1 Response surface design and corresponding experimental and predicted extraction yields of synephrine

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert軟件對(duì)表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到模型為：Y=5.59＋0.52X1＋0.71X2＋0.35X3＋0.28X1X2＋0.033X1X3＋0.033X2X3---，模型的可靠性可從方差分析及相關(guān)系數(shù)來(lái)考察。

從表2方差分析結(jié)果可知，F(xiàn)=43.95，說(shuō)明本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(P=0.0003＜0.05)。在總的作用因素中，回歸方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的P值均小于0.05，表明這兩項(xiàng)均具有很高的顯著性；交互項(xiàng)的P值大于0.05，說(shuō)明這3個(gè)因素之間的交互作用不大。失擬項(xiàng)在P=0.05水平上不顯著(P=0.1162＞0.05)，相關(guān)性系數(shù)R2=0.9875，說(shuō)明模型能夠很好的反應(yīng)響應(yīng)值的變化，擬合度好?？梢杂么四Ｐ蛠?lái)分析和預(yù)測(cè)超聲波提取枳實(shí)有效成分辛弗林的工藝結(jié)果。

表2 回歸模型各項(xiàng)方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.3 提取工藝的響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

圖6 各兩因素交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surfaces showing the effects of material particle size and ethanol concentration, ethanol concentration and extraction time, and extraction time and material particle size on extraction yield of synephrine

比較圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和粒度對(duì)辛弗林提取效果的影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線(xiàn)較陡，響應(yīng)值變化較大，最佳值為乙醇體積分?jǐn)?shù)67.90%、粒度32.33目；提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響較小，曲線(xiàn)較為平滑，對(duì)響應(yīng)值變化較小，最佳值為提取時(shí)間16.38min。但考慮到實(shí)際操作的局限性，并結(jié)合表2方差分析的結(jié)果，將枳實(shí)提取工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)67.90%、枳實(shí)粒度30目、提取時(shí)間16min。在此條件下，辛弗林的預(yù)測(cè)提取率可達(dá)到5.77mg/g。

在此修正條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，辛弗林的提取量平均值達(dá)到5.87mg/g，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合，表明響應(yīng)面分析的優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際值相吻合，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

2.3 超聲輔助提取與熱回流提取法的比較

為了評(píng)價(jià)超聲輔助法提取辛弗林的效率，對(duì)比研究了超聲輔助提取和熱回流提取法的提取工藝，結(jié)果如表3所示。熱回流法提取過(guò)程所需時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低，而超聲波輔助提取法由于超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)及強(qiáng)烈空化效應(yīng)使得細(xì)胞破碎，加大了顆粒和液體之間的接觸面積，并加速藥物有效成分滲透進(jìn)入溶劑，從而獲得更高的提取率，并且所需提取時(shí)間大大縮短[13-15]。超聲輔助提取15min所得到的辛弗林的提取率比熱回流提取2h的提取率還稍高。由此可見(jiàn)，超聲波輔助提取在一定程度上可以提高生產(chǎn)效率、減小能量消耗，具有良好發(fā)展前景。

表3 超聲輔助提取與熱回流提取結(jié)果對(duì)比Table 3 Comparison of ultrasound-assisted extraction and reflux extraction of synephrine

3 結(jié) 論

綜合各方面考慮，超聲波輔助提取枳實(shí)中辛弗林是相比傳統(tǒng)熱回流提取法更為方便和有效的方法。超聲波輔助提取有提取時(shí)間短、能耗小、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。

采用響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助提取枳實(shí)中生物堿辛弗林工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的提取工藝條件為枳實(shí)顆粒度30目、乙醇體積分?jǐn)?shù)67.90%、液固比12∶1(mL/g)、提取時(shí)間16min、超聲功率420W，此條件下辛弗林提取量可達(dá)5.87mg/g。

[1]袁丹, 王青, 王啟隆, 等. 枳實(shí)及其提取物質(zhì)量評(píng)價(jià)法的研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2005, 40(15)∶ 1178-1179.

[2]蔡艷華. 枳實(shí)中生物堿辛弗林的提取分離研究[D]. 成都∶ 四川大學(xué), 2005.

[3]陳志紅, 苗兵, 李劍敏. 微波強(qiáng)化提取枳實(shí)中辛弗林的工藝研究[J].應(yīng)用化工, 2008, 37(6)∶ 589-591.

[4]鄒建國(guó), 徐小龍, 劉燕燕, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取馬錢(qián)子中生物堿的工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(16)∶ 111-114.

[5]黃璞, 謝明勇, 聶少平, 等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取黑靈芝孢子多糖工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(10)∶ 200-203.

[6]周向輝, 潘治利, 陳松江, 等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波提取漿棗棗皮多酚工藝的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(11)∶ 265-268.

[7]李效賢, 王芳芳, 余陳歡, 等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化茶樹(shù)菇多糖的提取工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(19)∶ 24-26.

[8]賴(lài)紅芳, 林翠梧, 陳海燕, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取扶芳藤抗氧化物[J]. 精細(xì)化工, 2008, 25(9)∶ 869-871.

[9]FAN Jieping, ZHANG Ruifen, ZHU Jianghang. Optimization of microwave assisted extraction of total triterpenoid in Diospyros kaki leaves using response surface methodology[J]. Asian Journal of Chemistry, 2010, 22(5)∶ 3487-3500.

[10]王海凌, 侯團(tuán)章. HPLC法測(cè)定上海地區(qū)不同采摘期枳實(shí)中辛弗林含量[J]. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 28(5)∶ 377-378.

[11]王姿媛, 孫亦群. HPLC法測(cè)定陳皮、青皮中辛弗林的含量[J]. 中藥材, 2009, 32(6)∶ 913-914.

[12]NIEMANN R A, GAY M L. Determination of ephedrine alkaloids and synephrine in dietary supplements by column-switching cation exchange high-performance liquid chromatography with scanning-wavelength ultraviolet and fluorescence detection[J]. J Agric Food Chem, 2003, 51 (19)∶ 5630-5638.

[13]高蓉, 陳練洪, 李穩(wěn)宏, 等. 超聲法提取化香樹(shù)果序中黃酮類(lèi)化合物工藝[J]. 化學(xué)工程, 2007, 35(8)∶ 65-73.

[14]徐懷德. 天然產(chǎn)物提取工藝學(xué)[M]. 北京∶ 中國(guó)輕工業(yè)出版社, 2006∶51-52.

[15]HUANG Wen, XUE An, NIU Hai, et al. Optimised ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Folium eucommiae and evaluation of antioxidant activity in multi-test systems in vitro[J]. Food Chemistry, 2009, 114(3)∶ 1147-1154.

Optimization of Ultrasound-assisted Extraction Process for Synephrine from Citrus aurantium Fruit by Response Surface Methodology

ZHANG Lu，F(xiàn)AN Jie-ping*，CAO Jing，KONG Tao，TONG Sheng
(School of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

On the basis of one-factor-at-a-time experiments, response surface methodology was employed to the ultrasoundassisted extraction of synephrine from Citrus aurantium fruit. A quadratic regression model was established to investigate the extraction yield of synephrine with respect to three extraction parameters such as ethanol concentration, material particle size and ultrasound treatment time. The optimal extraction conditions determined were material particle size of 30 mesh, ethanol concentration of 67.90%, liquid-to-solid ratio of 12∶1 (mL/g), extraction time of 16 min, and ultrasonic power of 420 W. Under these conditions, the extraction yield of synephrine was up to 5.87 mg/g, which was consistent with the predicted value of 5.77 mg/g. Thus, the established regression model had good feasibility.

Citrus aurantium；synephrine；ultrasound-assisted extraction；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2011)14-0001-05

2010-08-31

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(20806037)

張璐(1988—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锓蛛x。E-mail：330031@163.com

*通信作者：范杰平(1974—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)榛し蛛x和精細(xì)化工。E-mail：jasperfan@163.com