張 璐，范杰平，曹 婧，孔 濤，童 聲

(南昌大學環(huán)境與化學工程學院，江西 南昌 330031)

響應面法優(yōu)化枳實中辛弗林的超聲輔助提取工藝

張 璐，范杰平*，曹 婧，孔 濤，童 聲

(南昌大學環(huán)境與化學工程學院，江西 南昌 330031)

在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對超聲波輔助提取枳實中生物堿辛弗林的工藝進行優(yōu)化，預測得到最實驗佳條件。結果表明：超聲波法提取枳實中生物堿辛弗林的最佳工藝條件為枳實顆粒度30目、乙醇體積分數(shù)67.90%、液固比12∶1(mL/g)、提取時間16min、超聲功率420W，在此條件下，辛弗林的提取量達到5.87mg/g。該工藝提取結果與理論預測值5.77mg/g基本吻合，說明該優(yōu)化方法可行。

枳實；辛弗林；超聲提??；響應面法

枳實為蕓香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培變種的干燥未成熟果實或甜橙的干燥幼果。主要含揮發(fā)油、辛弗林、N-甲基酪胺、橙皮甙、VC及VD等。始載于神農本草經(jīng)，具有破氣消積，化痰散痞之功效。辛弗林是積實中的一種生物堿，是枳實中起主要藥理作用的有效成分，具有收縮血管、升高血壓和較強的擴張氣管、支氣管的作用，能夠提高新陳代謝、增加熱量消耗、提高能量水平、氧化脂肪，并能緩解因肥胖引起的輕度和中度抑郁癥狀[1-3]。因此辛弗林廣泛應用于醫(yī)藥、食品、飲料等保健行業(yè)。

由于該天然產物含量較低，而傳統(tǒng)的提取工藝如煎煮法、熱回流法等則有耗時長、提取率低等不足，所以應考慮采用一些新的物理輔助提取手段[4]。本實驗采用超聲波輔助方法對枳實中辛弗林的提取工藝進行研究，并在單因素試驗的基礎上，通過響應面法[5-9]對其工藝條件進行優(yōu)化，為選擇和制訂枳實中辛弗林的提取工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枳實(生品)產自江西。

辛弗林標準品(純度98.66%) 陜西森弗生物技術有限公司；甲醇(色譜純)、無水乙醇(分析純) 天津大茂化學試劑廠。

1100高效液相色譜儀(配有四元泵及自動進樣器、DAD檢測器) 美國安捷倫公司；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器(超聲頻率40kHz、超聲最大功率600W、功率可調40%～100%、加熱最大功率800W、溫度可調10～80℃) 昆山市超聲儀器有限公司；FZ-102微型植物粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；KDC-160HR型離心機科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；FA2104型電子天平 上海倫捷機電儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枳實中生物堿辛弗林的提取

枳實經(jīng)粉碎，篩分，烘干，備用。精密稱取枳實樣品0.5g，采用超聲輔助提取法，用乙醇溶液提取枳實中生物堿辛弗林，將提取液用高速離心機離心20min。取上清液1mL，用甲醇定容至10mL，經(jīng)高效液相色譜儀分析檢測，進樣前樣品通過0.45μm的濾膜過濾。結果以提取率Y表示。

式中：C表示提取液辛弗林的質量濃度/(g/mL)；V表示加入溶劑的體積/mL；m為枳實的質量/g。

1.2.2 色譜條件

根據(jù)文獻[10-12]條件，經(jīng)過實驗優(yōu)化后，測定辛弗林的高效液體色譜條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，流動相為甲醇∶緩沖鹽溶液(0.02% H3PO4、0.1%十二烷基硫酸鈉、0.02%三乙胺)= 60∶40，柱溫30℃，流速0.8mL/min，檢測波長224nm。

1.2.3 標準曲線的繪制

精密稱取辛弗林6mg，置10mL容量瓶中，加無水甲醇至刻度作為對照品溶液。分別進樣0.2、0.5、1.0、2.0、3.0μL，測定其峰面積，繪制標準曲線，辛弗林的標準曲線回歸方程為y=591.36057χ-16.0981(R2=0.9999)，式中，y為辛弗林峰面積/(mAU·s)、χ為進樣量/μg。結果表明辛弗林在0.12～1.8μg范圍內線性關系良好。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 粒度對提取率的影響

在乙醇體積分數(shù)65%、提取時間15min、液固比12∶1 (mL/g)、功率480W的條件下考察枳實粒度(20～60目)對提取率的影響，結果如圖1所示。

由圖1可知，當粒徑為20目時辛弗林提取率最低，而當粒徑為30目時提取率達到最高，隨之，提取率隨著粒徑減小而下降。這是由于當粒徑過大時，顆粒與溶劑之間的有效接觸不好，從而影響提取效率；而當顆粒體積過小時，會有過多雜質溶出且顆粒容易成團，這將導致提取率下降。因此30目被選為最佳的粒徑大小。

圖1 粒度對提取率的影響Fig.1 Effect of material particle size on extraction yield of synephrine

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響

在枳實粒度30目、提取時間15min、液固比12∶1、功率480W的條件下考察乙醇體積分數(shù)(35%～95%)對提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2 乙醇體積分數(shù)對提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of synephrine

由圖2可知，辛弗林產量隨著乙醇體積分數(shù)的增加而提高，當乙醇體積分數(shù)為65%時，提取率達到最高，之后提取率隨乙醇體積分數(shù)降低而下降。根據(jù)相似相溶原理，極性相似可以達到最大溶出度，當乙醇體積分數(shù)為65%時，其極性與辛弗林相似，因此65%乙醇為最佳提取溶劑。

2.1.3 液固比對提取率的影響

圖3 液固比對提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction yield of synephrine

在枳實粒度30目、乙醇體積分數(shù)65%、提取時間15min、功率480W的條件下，考察液固比6∶1～14∶1(mL/g)對提取率的影響，結果如圖3所示。

如圖3所示，辛弗林提取率隨著液固比的增大而提高，當液固比為12∶1時提取率達到最大，之后提取率隨其增大而減小。這是由于過多的溶劑使得超聲波對枳實的穿透作用減小，從而導致提取率下降。因此，12∶1被選為最佳的液固比。

2.1.4 提取時間對提取率的影響

在枳實粒度30目、乙醇體積分數(shù)65%、液固比12∶1、功率480W的條件下，考察提取時間(5～25min)對提取率的影響，結果如圖4所示。

圖4 提取時間對提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction yield of synephrine

由圖4可知，辛弗林提取率隨著提取時間的增加而增加，而當提取時間超過15min后，辛弗林提取率的變化已經(jīng)很小。因此，從節(jié)省時間和能耗的角度考慮，選擇15min為最佳提取時間。

2.1.5 超聲功率對提取率的影響

在枳實粒度30目、乙醇體積分數(shù)65%、提取時間15min、液固比12∶1的條件下，考察超聲功率(300～540W)對提取率的影響，結果如圖5所示。

圖5 超聲功率對提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasound power on extraction yield of synephrine

由圖5可知，辛弗林提取率隨超聲功率的增大而提高，當超聲功率為420W時提取率達到最大，之后提取率隨之增大而下降。隨著超聲功率增大，分子擴散速度越大，提取率增大，而當功率過大時，可能一些糖類和蛋白質等雜質也會溶出，辛弗林被吸附在固體基質上而不易被提取，從而導致提取率下降。因此，420W被選為最佳超聲功率。

2.2 響應面法優(yōu)化枳實有效成分辛弗林提取工藝

2.2.1 響應面分析方案及試驗結果

通過單因素試驗基礎可知，乙醇體積分數(shù)(X1)、枳實粒度(X2)、提取時間(X3)為3個對枳實辛弗林提取率影響較大的因素。因此根據(jù)Box-Behnken試驗設計，選取這3個因素對提取工藝進行響應面分析，以優(yōu)化超聲輔助提取枳實有效成分辛弗林的工藝條件，其具體試驗方案及結果見表1。

表1 枳實有效成分辛弗林提取響應面分析方案及計算分析結果Table 1 Response surface design and corresponding experimental and predicted extraction yields of synephrine

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗

利用Design-Expert軟件對表1試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，得到模型為：Y=5.59＋0.52X1＋0.71X2＋0.35X3＋0.28X1X2＋0.033X1X3＋0.033X2X3---，模型的可靠性可從方差分析及相關系數(shù)來考察。

從表2方差分析結果可知，F(xiàn)=43.95，說明本試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(P=0.0003＜0.05)。在總的作用因素中，回歸方程一次項、二次項的P值均小于0.05，表明這兩項均具有很高的顯著性；交互項的P值大于0.05，說明這3個因素之間的交互作用不大。失擬項在P=0.05水平上不顯著(P=0.1162＞0.05)，相關性系數(shù)R2=0.9875，說明模型能夠很好的反應響應值的變化，擬合度好。可以用此模型來分析和預測超聲波提取枳實有效成分辛弗林的工藝結果。

表2 回歸模型各項方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.3 提取工藝的響應曲面分析與優(yōu)化

圖6 各兩因素交互作用對提取率影響的響應面圖Fig.6 Response surfaces showing the effects of material particle size and ethanol concentration, ethanol concentration and extraction time, and extraction time and material particle size on extraction yield of synephrine

比較圖6可知，乙醇體積分數(shù)和粒度對辛弗林提取效果的影響較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，響應值變化較大，最佳值為乙醇體積分數(shù)67.90%、粒度32.33目；提取時間對響應值的影響較小，曲線較為平滑，對響應值變化較小，最佳值為提取時間16.38min。但考慮到實際操作的局限性，并結合表2方差分析的結果，將枳實提取工藝條件修正為乙醇體積分數(shù)67.90%、枳實粒度30目、提取時間16min。在此條件下，辛弗林的預測提取率可達到5.77mg/g。

在此修正條件下進行3次重復驗證實驗，辛弗林的提取量平均值達到5.87mg/g，與理論預測值基本吻合，表明響應面分析的優(yōu)化結果與實際值相吻合，具有一定的實用價值。

2.3 超聲輔助提取與熱回流提取法的比較

為了評價超聲輔助法提取辛弗林的效率，對比研究了超聲輔助提取和熱回流提取法的提取工藝，結果如表3所示。熱回流法提取過程所需時間長、提取效率低，而超聲波輔助提取法由于超聲波產生的強烈振動及強烈空化效應使得細胞破碎，加大了顆粒和液體之間的接觸面積，并加速藥物有效成分滲透進入溶劑，從而獲得更高的提取率，并且所需提取時間大大縮短[13-15]。超聲輔助提取15min所得到的辛弗林的提取率比熱回流提取2h的提取率還稍高。由此可見，超聲波輔助提取在一定程度上可以提高生產效率、減小能量消耗，具有良好發(fā)展前景。

表3 超聲輔助提取與熱回流提取結果對比Table 3 Comparison of ultrasound-assisted extraction and reflux extraction of synephrine

3 結 論

綜合各方面考慮，超聲波輔助提取枳實中辛弗林是相比傳統(tǒng)熱回流提取法更為方便和有效的方法。超聲波輔助提取有提取時間短、能耗小、提取效率高等優(yōu)點。

采用響應面法對超聲波輔助提取枳實中生物堿辛弗林工藝條件進行優(yōu)化，得到最佳的提取工藝條件為枳實顆粒度30目、乙醇體積分數(shù)67.90%、液固比12∶1(mL/g)、提取時間16min、超聲功率420W，此條件下辛弗林提取量可達5.87mg/g。

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Optimization of Ultrasound-assisted Extraction Process for Synephrine from Citrus aurantium Fruit by Response Surface Methodology

ZHANG Lu，F(xiàn)AN Jie-ping*，CAO Jing，KONG Tao，TONG Sheng
(School of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

On the basis of one-factor-at-a-time experiments, response surface methodology was employed to the ultrasoundassisted extraction of synephrine from Citrus aurantium fruit. A quadratic regression model was established to investigate the extraction yield of synephrine with respect to three extraction parameters such as ethanol concentration, material particle size and ultrasound treatment time. The optimal extraction conditions determined were material particle size of 30 mesh, ethanol concentration of 67.90%, liquid-to-solid ratio of 12∶1 (mL/g), extraction time of 16 min, and ultrasonic power of 420 W. Under these conditions, the extraction yield of synephrine was up to 5.87 mg/g, which was consistent with the predicted value of 5.77 mg/g. Thus, the established regression model had good feasibility.

Citrus aurantium；synephrine；ultrasound-assisted extraction；response surface methodology

TS201.1

A

1002-6630(2011)14-0001-05

2010-08-31

國家自然科學基金青年科學基金項目(20806037)

張璐(1988—)，女，碩士研究生，研究方向為天然藥物分離。E-mail：330031@163.com

*通信作者：范杰平(1974—)，男，副教授，博士，研究方向為化工分離和精細化工。E-mail：jasperfan@163.com