樊賀明 楊明妍 畢峰

線粒體基因組也叫線粒體DNA(mtDNA，Mitochondrial DNA)，結(jié)構(gòu)與細(xì)菌DNA相似，呈雙鏈環(huán)狀，可獨(dú)立編碼一些蛋白質(zhì)，是核外遺傳物質(zhì)，人們?cè)诰€粒體中已發(fā)現(xiàn)RNA、DNA聚合酶、RNA聚合酶、tRNA、核糖體等全套裝備，說明線粒體具有獨(dú)立的遺傳體系。

1 mtDNA的構(gòu)成

mtDNA分子為環(huán)狀雙鏈DNA分子，外環(huán)為重鏈（H），內(nèi)環(huán)為輕鏈（L）?；蚺帕蟹浅＞o湊，除與mtDNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一小段區(qū)域外，無內(nèi)含子序列。每個(gè)線粒體含數(shù)個(gè)mtDNA，動(dòng)物組織mtDNA約16～20kb，大多數(shù)基因由H鏈轉(zhuǎn)錄，包括2個(gè)rRNA，14個(gè)tRNA和12個(gè)編碼多肽的mRNA，L鏈編碼另外8個(gè)tRNA和一條多肽鏈。mtDNA上的基因相互連接或僅間隔幾個(gè)核苷酸序列，一些多肽基因相互重疊，幾乎所有閱讀框都缺少非翻譯區(qū)域。很多基因沒有完整的終止密碼，而僅以T或TA結(jié)尾，mRNA的終止信號(hào)是在轉(zhuǎn)錄后加工時(shí)加上去的。

2 mtDNA的組成特點(diǎn)

mtDNA是一共價(jià)閉合的雙鏈環(huán)狀遺傳物質(zhì),具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于分離、拷貝數(shù)高、突變率高、進(jìn)化速度快、母性遺傳、無組織特異性等特點(diǎn)。其分子大小在14～42kb之間，絕大多數(shù)介于16～18kb,mtDNA已被廣泛應(yīng)用于發(fā)病機(jī)理、臨床診斷、遺傳變異、生物進(jìn)化等多方面的研究，并已在分類學(xué)、種系鑒定、遺傳學(xué)、進(jìn)化論等領(lǐng)域取得一定的成就[1]。對(duì)大量不同動(dòng)物(包括人在內(nèi)的13種哺乳動(dòng)物、2種鳥類、2種兩棲類、6種魚類、4種爬行類、6種昆蟲類等) 線粒體基因組全序列測(cè)定表明, 動(dòng)物線粒體基因由大致為15～20kb的雙鏈環(huán)狀DNA分子組成。雙鏈3′端是一段具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的高保守性控制區(qū),控制線粒體DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。這一區(qū)域多是串聯(lián)重復(fù)序列，并在核DNA上有同源區(qū)。它與轉(zhuǎn)座、錯(cuò)配表達(dá)和線粒體基因異質(zhì)(heteroplasmy)相關(guān)[2-3]。

3 mtDNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

mtDNA結(jié)構(gòu)基因排列緊湊,幾乎沒有間隙序列和內(nèi)含子。在編碼脯氨酸和苯丙氨酸t(yī)RNA的基因之間,由少數(shù)堿基構(gòu)成一個(gè)突出結(jié)構(gòu)—D環(huán),它由與輕鏈互補(bǔ)的一小段DNA合成,并在這一區(qū)域取代了重鏈。D環(huán)是mtDNA與細(xì)胞核相聯(lián)絡(luò)的重要區(qū)域,也是mtDNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。該區(qū)在人、鼠、豬的mtDNA中是相當(dāng)保守的,可形成一種發(fā)夾樣次級(jí)結(jié)構(gòu)。這一結(jié)構(gòu)可與線粒體引發(fā)酶、γ-DNA-多聚酶和線粒體拓外異物酶Ⅰ和Ⅱ等強(qiáng)烈結(jié)合[4]。

4 mtDNA 的制備方法

mtDNA制備方法是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，目前已有較多報(bào)道，可分為：超速離心法、差速離心法、堿裂解法和柱層析法?，F(xiàn)將國(guó)內(nèi)外幾種較好的提取組織線粒體DNA的方法進(jìn)行比較[5]。

4.1 非離子型去污劑法

戴紀(jì)剛等利用非離子型去污劑TrionX-100能溶解除核膜以外的所有細(xì)胞膜的特點(diǎn)，建立了一種通過核質(zhì)分離技術(shù)制備mtDNA的方法。通過適當(dāng)?shù)碾x心，分離細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)來獲取mtDNA。其主要優(yōu)點(diǎn)是不需要分離細(xì)胞的總DNA，也不需要分離和純化細(xì)胞線粒體，而是從完整細(xì)胞直接分離mtDNA，方法簡(jiǎn)單快速，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑要求不高，一般實(shí)驗(yàn)室均可應(yīng)用。由此可見，本方法制備mtDNA完全可以滿足常規(guī)的研究工作的需要。

4.2 差速離心法

朱克軍等[6]以差速離心法分離線粒體,用堿性SDS法裂解線粒體膜,釋放線粒體DNA后用酚/氯仿抽提,TE或ddH2O溶解，然后將所得線粒體DNA進(jìn)行純度鑒定，并和其他方法制備的線粒體DNA經(jīng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增,比較擴(kuò)增效果。

4.3 密度梯度離心法

密度梯度離心法純化DNA是一種廣泛應(yīng)用的方法，其突出優(yōu)點(diǎn)是獲得的DNA純度高。但經(jīng)典的等密度梯度離心法的離心時(shí)間需要48～60h，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，儀器損耗大，對(duì)于電壓不穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)室，這個(gè)問題還直接危及儀器的安全，而且，DNA樣品長(zhǎng)時(shí)間暴露在高濃度的鹽(如CoCI)溶液中，容易受損傷。徐秀英等[7]采用兩級(jí)梯度離心法純化DNA，離心時(shí)間只需5h，離心效果與48h經(jīng)典的密度梯度離心法無明顯差別，達(dá)到了快速純化的目的。

4.4 堿裂解法

堿裂解法，即SDS堿裂解法。其主要原理是通過使細(xì)胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，相互纏繞成大型復(fù)合物，被十二烷基磺酸鈉包蓋，當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí)，復(fù)合物會(huì)從溶液中有效沉淀下來，離心后即可從上清中回收質(zhì)粒DNA。(1)Tamura等[8]通過改進(jìn)提取質(zhì)粒DNA的堿裂解法來提取線粒體DNA,優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便快捷，缺點(diǎn)是微量制備，如果要檢測(cè)大量個(gè)體，堿裂解法就會(huì)顯得非常麻煩和費(fèi)時(shí)。(2)劉麗紅等[9]提出了一種直接以組織細(xì)胞制備mtDNA的技術(shù)方法，其優(yōu)點(diǎn):①對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑要求不高,一般實(shí)驗(yàn)室均可應(yīng)用。②該方法對(duì)標(biāo)本要求不高，-70℃冰凍保存或液氮保存即可。③mtDNA產(chǎn)率有極大提高,mtDNA樣品紫外分光光度檢測(cè)結(jié)果表明,每克組織可獲得約8μg mtDNA。④不需要分離細(xì)胞的總DNA，也不需要分離和純化細(xì)胞線粒體,而是從完整細(xì)胞直接分離mtDNA。因此,本方法簡(jiǎn)便快速,僅需2～3h,重復(fù)性好。⑤本方法尤其適用于標(biāo)本量少,經(jīng)費(fèi)不足時(shí)mtDNA模板的制備。⑥用本方法所得mtDNA樣品純度高。

4.5 柱層析法

層析分離技術(shù)是一種物理的分離方法、它利用混合物中的各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別（如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等），各組分以不同程度分布在兩相中，從而使各組分以不同速度移動(dòng)而達(dá)到分離。柱層析法是利用各分子形狀和大小不同，在層析柱中的流速不同而將各組分分離。此方法操作簡(jiǎn)單，效果好，重復(fù)性高，應(yīng)用廣泛。常用于線粒體分離[10]。

人類及絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞mtDNA都是閉環(huán)雙鏈DNA分子。動(dòng)物組織線粒體DNA的提取方法依其動(dòng)物本身組織的不同特點(diǎn)，從方法學(xué)研究角度看,對(duì)新鮮動(dòng)物線粒體DNA提取分離方法常用的有酚氯仿萃取、乙醇沉淀、CsC1超速離心、酸性緩沖液、堿性緩沖液等[11]。而對(duì)中藥材來說,DNA一般因加工、干燥、儲(chǔ)藏等過程部分降解同時(shí)易受到細(xì)胞中抑制PCR的蛋白質(zhì)、多糖類、多酚類成分的影響,在提取DNA時(shí)加入SDS等蛋白質(zhì)變性劑,在PCR時(shí)加入小牛血清蛋白(BSA)以滅活內(nèi)源性核糖酶,排除干擾PCR的色素物質(zhì)[12-13]。

分子遺傳學(xué)標(biāo)記技術(shù)為中藥材與易混品種的鑒別提供了一條新的途徑[14]。線粒體DNA（mtDNA）作為遺傳信息的載體，是研究動(dòng)物起源進(jìn)化及對(duì)群體進(jìn)行遺傳分析的理想對(duì)象，線粒體細(xì)胞色素b[15-16]（cytb）基因進(jìn)化速度適中，是分析種內(nèi)、種間遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系的適當(dāng)DNA片段，可應(yīng)用于生物的分類、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性的研究[17]。

5 應(yīng)用前景

我國(guó)雖有豐富的中草藥資源，但由于缺乏系統(tǒng)的整理和歸類，致使中藥材同名異物、同物異名的現(xiàn)象屢有發(fā)生；中藥商品市場(chǎng)混亂，多有以假充真、以次充好的情況；隨著人們“回歸自然”迫切需求，中藥需求量的日益擴(kuò)大，資源矛盾日趨尖銳。而解決這些問題的關(guān)鍵是要有一套簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確有效的鑒別中藥材正品的技術(shù)與方法，以杜絕假、劣及混淆品的干擾；找出形成質(zhì)量?jī)?yōu)、產(chǎn)量高的道地藥材的機(jī)制，明確其生長(zhǎng)條件，以培育出更多優(yōu)質(zhì)的重要原材料；對(duì)于珍稀、瀕危動(dòng)植物，則需要大力保護(hù)，積極尋找替代品，或根據(jù)習(xí)性進(jìn)行人工栽培和繁殖[18]。

目前，分子生物學(xué)技術(shù)已成為中藥DNA指紋圖譜鑒定的一項(xiàng)主要技術(shù)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在中藥鑒定和質(zhì)量檢測(cè)方面均有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，但仍需完善[19]。而動(dòng)物mtDNA的研究已廣泛滲透到保護(hù)生物學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、分類學(xué)等學(xué)科中。早期的mtDNA的研究主要集中于限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP），近年來，隨著DNA測(cè)序技術(shù)的成熟和普及，mtDNA的研究不斷深入，應(yīng)用日趨廣泛[20]。

總之，DNA指紋圖譜技術(shù)具有快速、微量、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，且不受生長(zhǎng)發(fā)育階段、供應(yīng)部位、環(huán)境條件的影響，已在中藥鑒定學(xué)研究中展示了良好的應(yīng)用前景，并保持了強(qiáng)勁的發(fā)展勢(shì)頭[21]。

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