林松毅，許海麗，孟秀娟，高麗霞，孫 鵬，劉靜波

水迷宮評價蛋清高F值寡肽增強小鼠記憶功效的影響因素分析

林松毅，許海麗，孟秀娟，高麗霞，孫 鵬，劉靜波*

(吉林大學軍需科技學院營養(yǎng)與功能食品研究室，吉林 長春 130062)

以蛋清高F值寡肽為受試物，借助SMG-2水迷宮程序自動控制儀4個盲端評價方法，綜合分析受試小鼠90d潛伏期變化情況，以考察蛋清高F值寡肽和SMG-2水迷宮4個盲端對小鼠潛伏期的影響。結(jié)果表明：給予蛋清高F值寡肽的小鼠在盲端Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區(qū)的潛伏期和對照組小鼠的潛伏期都表現(xiàn)出了顯著性差異(P＜0.05)；通過對不同測試時間的潛伏期之間的顯著性檢驗，表明受試小鼠的潛伏期在受試第60天時開始和之前的潛伏期有顯著性差異。并且小鼠在盲端Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ區(qū)的潛伏期對訓練時間的依賴性是逐漸增加的，既迷宮越復雜，小鼠對受試時間的依賴性越弱。SMG-2水迷宮程序自動控制儀評價蛋清高F值寡肽對小鼠的記憶時，選擇盲端Ⅰ、Ⅱ區(qū)的潛伏期進行統(tǒng)計分析。

增強記憶；水迷宮；盲端；受試時間

高F值寡肽是一個由2～9個氨基酸殘基所組成的混合小肽(或稱寡肽)體系，F(xiàn)值(Fischer ratio)，是支鏈氨基酸(BCAA：Val、Ile、Leu)與芳香族氨基酸(AAA：Trp、Tyr、Phe)含量的物質(zhì)的量比值[1]，高F值寡肽具有消除或減輕肝性腦病癥狀、改善肝功能和改善多種病人蛋白質(zhì)營養(yǎng)失常狀態(tài)及抗疲勞等功能[2]。近幾年，國內(nèi)高F值寡肽開發(fā)成為功能食品的研究熱點[3]。許多有獨特序列的肽還具有特殊的生理功能。肽對神經(jīng)系統(tǒng)也有調(diào)節(jié)作用，是神經(jīng)系統(tǒng)的重要活性物質(zhì)，如腦啡肽、內(nèi)啡肽等均含有典型的N末端序列：Tye-Gly-Gly-Phe，是一類具有激素和神經(jīng)遞質(zhì)雙重特性的生物活性物質(zhì)，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官[4]。一些低相對分子質(zhì)量的活性寡肽已經(jīng)成為當前食品科學界研究最為熱門的課題之一[5]。用水迷宮測試方法研究干預(yù)因素對動物學習、記憶和空間定向及認知能力的影響，已經(jīng)得到世界各國從事認知領(lǐng)域研究的科學家認可并推廣和應(yīng)用[6]。SMG-2水迷宮自動控制儀是測定小鼠立體空間學習記憶能力的常用儀器，但其設(shè)計有優(yōu)點也有缺點[7]。

在課題組前期研究的基礎(chǔ)上[7]和對水迷宮實驗研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)上[8-16]，本實驗對給予蛋清高F值寡肽的小鼠在SMG-2水迷宮的4個盲端的潛伏期進行比較和研究，以研究蛋清高F值寡肽和SMG-2水迷宮4個盲端對受試小鼠潛伏期的影響。進而為后期的蛋清高F值寡肽改善記憶評價研究和小鼠改善記憶評價體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

雄性小白鼠，昆明種，清潔級，體質(zhì)量(20±2)g，由吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院提供；實驗動物全價顆粒飼料：其生產(chǎn)許可證為SCXK-(吉)2003—2008，由長春市綠園區(qū)益生實驗動物飼料廠生產(chǎn)，由吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院動物實驗中心監(jiān)制。

蛋清高F值寡肽由吉林大學軍需科技學院營養(yǎng)與功食品研究室提供，F(xiàn)值為47[6]；雙蒸水由吉林大學軍需科技學院營養(yǎng)與功能食品研究室提供。

SMG-2水迷宮程序自動控制儀 中國醫(yī)學科學院藥物研究所；灌胃針。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

選取70只健康的昆明種雄性小白鼠經(jīng)過3d實驗條件的飼養(yǎng)后，按體質(zhì)量隨機分為7個實驗組，每組動物數(shù)為10，受試90d，組間經(jīng)t檢驗后無顯著性差異。

表1 受試90d小鼠實驗分組Table 1 The grouping of mice under intragastric administration for 90 d

1.2.2 小鼠水迷宮4個盲端潛伏期的測試

圖1 水迷宮示意圖Fig.1 Water maze diagram

連續(xù)給藥90d，在灌胃30d后開始訓練，訓練期間繼續(xù)給藥，每天一次。

訓練第1天用隔板將A點與B點的通道阻斷，小鼠被置于臺階上10s，使其了解此安全區(qū)域的存在，然后將小鼠放于起點A，讓其自由游泳，記錄小鼠從盲端Ⅳ到爬上安全臺階的時間(即潛伏期)，如果在訓練時間2min內(nèi)尚未找到臺階者，將會被引導到安全臺階處，其潛伏期被記為2min。第1次訓練后休息片刻按同樣方法訓練第2次。依次訓練其他小鼠。

在訓練的第2天，將隔板置于B點，小鼠的游泳起點為盲端Ⅲ，分別記錄小鼠爬上安全臺階的潛伏期，每只小鼠連續(xù)訓練2次。如果在2min找不到臺階者，將被引導到終點，其潛伏期被記為2min。在接下來的2d內(nèi)，依次訓練小鼠從盲端Ⅱ、Ⅰ開始到爬上安全臺階的潛伏期。以潛伏期為統(tǒng)計指標進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件及SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。用獨立樣本的t檢驗進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 水迷宮盲端Ⅰ區(qū)實驗結(jié)果與分析

2.1.1 受試時間對盲端Ⅰ區(qū)潛伏期影響的差異性分析

圖2 不同處理組和對照組在相同受試時間的盲端Ⅰ區(qū)潛伏期對比Fig.2 Comparison of incubation period of the blind-side 1 between treatment and control groups

如圖2所示，在受試時間為80d時，TR3組小鼠的潛伏期和對照組有顯著性差異(P＜0.05)，TR6組和對照組差異極顯著(P＜0.01)。在受試90d時，TR1組小鼠的潛伏期和對照組差異極顯著(P＜0.01)。

2.1.2 不同劑量受試物對盲端Ⅰ區(qū)潛伏期影響的差異性分析

如圖3所示，在不同的受試時間內(nèi)，對照組盲端Ⅰ區(qū)潛伏期無顯著性差異，說明受試時間的延續(xù)和每周一次的測試沒有對小鼠的盲端Ⅰ區(qū)潛伏期產(chǎn)生影響，排除了時間對盲端Ⅰ區(qū)潛伏期的影響。在受試70d時，對照組小鼠的潛伏期呈現(xiàn)了最低值，但是和其他時間的對照組的潛伏期相比無顯著性差異，說明受試70d時，小鼠本身對水迷宮產(chǎn)生了良好的條件反應(yīng)。在盲端Ⅰ區(qū)的潛伏期，TR3組小鼠不同測試時間的潛伏期表現(xiàn)出了更多的顯著性差異。相反的是，TR6組小鼠在盲端Ⅰ區(qū)和對照組表現(xiàn)出了較少的顯著性差異。

圖3 相同組別在不同時間內(nèi)的盲端Ⅰ區(qū)潛伏期對比Fig.3 Comparison of incubation period of the blind-side1 within the same groups

2.2 水迷宮盲端Ⅱ區(qū)實驗結(jié)果與分析

2.2.1 受試時間對盲端Ⅱ區(qū)潛伏期影響的差異性分析

圖4 不同處理組和對照組在相同受試時間的盲端Ⅱ區(qū)潛伏期對比Fig.4 Comparison of incubation period of the blind-side Ⅱ between treatment and control at the same testing time

如圖4所示，在盲端Ⅱ區(qū)，各實驗處理組和對照組沒有顯著性差異，只有在受試60d時，TR4組和對照組有顯著性差異(P＜0.05)。但是，各實驗組小鼠的盲端的潛伏期總體是下降的。

2.2.2 不同劑量受試物對盲端Ⅱ區(qū)潛伏期影響的差異性分析

如圖5所示，對照組小鼠的潛伏期在第70天時和第30天及第40天的潛伏期表現(xiàn)出了顯著性差異(P＜0.05)，同樣地，對照組第80天的潛伏期和第30天及第40天的潛伏期有顯著性差異(P＜0.05)；對照組第90天的潛伏期和第30天及第40天的潛伏期也表現(xiàn)出了顯著性差異，且第90天的潛伏期和第80天的潛伏期也有顯著性差異(P＜ 0.05)。說明在第70天時，時間的積累對小鼠盲端Ⅱ的潛伏期具有了顯著性的影響，既在第70天后，由于每隔一定時間對小鼠的水迷宮測試使小鼠本身對水迷宮產(chǎn)生了良好的條件反射。從對照組所對應(yīng)的柱形圖還可以看出，小鼠盲端Ⅱ區(qū)的潛伏期是隨著時間的延續(xù)而不斷減少的，這也可以得出時間對小鼠的盲端Ⅱ區(qū)潛伏期的影響是很大的，至第70天時開始表現(xiàn)出顯著性差異。此外，CTR組潛伏期對受試時間的直線方程為y=-0.4147x＋51.785，相關(guān)系數(shù)R為0.9756，說明受試時間越長，時間因素對潛伏期的影響將變得越來越大。并且除了TR6組外，各蛋清寡肽處理組小鼠的盲端Ⅱ區(qū)的潛伏期表現(xiàn)出了更多的顯著性差異。大多數(shù)處理組在受試第60天時開始表現(xiàn)出了顯著性差異。

圖5 相同組別在不同時間內(nèi)的盲端Ⅱ區(qū)潛伏期對比Fig.5 Comparison of incubation period of the blind-sideⅡ within the same groups at the different time

2.3 水迷宮盲端Ⅲ區(qū)實驗結(jié)果與分析

2.3.1 受試時間對盲端Ⅲ區(qū)潛伏期影響的差異性分析

圖6 不同處理組和對照組在相同受試時間的盲端Ⅲ區(qū)潛伏期對比Fig.6 Comparison of incubation period of the blind-side Ⅲ between treatment and control at the same time

如圖6所示，在小鼠受試30d和40d時，TR4組小鼠在盲端Ⅲ區(qū)的潛伏期和對照組相比表現(xiàn)出了極顯著性差異(P＜0.01)。

2.3.2 不同劑量受試物對盲端Ⅲ區(qū)潛伏期影響的差異性分析

如圖7所示，CTR組小鼠盲端Ⅲ的潛伏期，第60、80、90天的潛伏期和第30天及第40天的潛伏期差異顯著(P＜0.05)，CTR組潛伏期對受試時間的直線方程為y=-0.2388x+27.203，相關(guān)系數(shù)R為0.9492，同盲端Ⅱ區(qū)，時間的積累對游程最短的盲端Ⅲ區(qū)產(chǎn)生了很大的影響。

圖7 相同組別在不同時間內(nèi)的盲端Ⅲ區(qū)潛伏期對比Fig.7 Comparison of incubation period of the blind-sideⅢwithin the same groups

2.4 水迷宮盲端Ⅳ區(qū)實驗結(jié)果與分析

2.4.1 受試時間對盲端Ⅳ區(qū)潛伏期影響的差異性分析

圖8 不同處理組和對照組在相同受試時間的盲端Ⅳ區(qū)潛伏期對比Fig.8 Comparison of incubation period of the blind-sideⅣbetween treatment and control group at the same time

如圖8所示，在各不同的測試時間里，實驗處理組小鼠的潛伏期和對照組沒有表現(xiàn)出顯著性差異。但是各實驗組小鼠的潛伏期隨著時間延長是逐漸下降的。

2.4.2 不同劑量受試物對水迷宮盲端Ⅳ區(qū)潛伏期影響的差異性分析

圖9 相同組別在不同時間內(nèi)的盲端Ⅳ區(qū)潛伏期對比Fig.9 Comparison of incubation period of the blind-sideⅣwithin the same groups

如圖9所示，對照組小鼠盲端Ⅳ區(qū)潛伏期和時間的線性相關(guān)系數(shù)為0.9501，除了TR5組小鼠以外，其他各組小鼠在盲端Ⅳ區(qū)的潛伏期在受試第70天時和第30天的潛伏期有顯著性差異。

因此，不同劑量的蛋清高F值寡肽能在不同程度上縮短小鼠的潛伏期，也說明了水迷宮的游程越長，實驗處理組和對照組越易于表現(xiàn)出顯著性差異；游程越短，處理組和對照組之間的差異越難表現(xiàn)出來。所有實驗處理組和對照組的盲端Ⅰ區(qū)的潛伏期在第60天時只是出現(xiàn)稍微的下降，而各實驗處理組和對照組的盲端Ⅱ～Ⅳ的潛伏期在第60天時則呈現(xiàn)了明顯的下降的趨勢，說明了水迷宮的游程越短，時間對潛伏期的影響越顯著。也就是說，迷宮的路程越復雜，小鼠的潛伏期對時間的依賴性越弱。

3 結(jié) 論

與灌胃雙蒸水的對照組相比，受試蛋清寡肽小鼠的潛伏期在受試第60天時和對照組開始表現(xiàn)出了顯著性差異。說明小鼠在受試第60天時蛋清高F值對小鼠的潛伏期有顯著影響，能縮短小鼠在水迷宮中的潛伏期。對小鼠的記憶具有一定的改善作用。

各盲端的CTR組小鼠和時間的線性方程的R值都超過了0.9，說明時間的積累對潛伏期的影響將變得越來越大。

通過對小鼠在不同盲端潛伏期之間的比較，發(fā)現(xiàn)水迷宮的游程越短，時間對潛伏期的影響越顯著；迷宮的路程越復雜，小鼠的潛伏期對受試時間的依賴性越弱。所以在用SMG-2通道式水迷宮進行動物實驗時，應(yīng)選擇盲端Ⅰ、Ⅱ區(qū)的潛伏期進行統(tǒng)計分析，以減少時間因素對實驗結(jié)果的影響。

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Analysis of Influence Factors of Memory Enhancement in Mice Administrated with High F Value Oligopeptide in Water Maze

LIN Song-yi，XU Hai-li，MENG Xiu-juan，GAO Li-xia，SUN Peng，LIU Jing-bo*
(Laboratory of Nutrition and Functional Food, College of Quartermaster Technology, Jilin University, Changchun 130062, China)

The objective of this study was to observe the effect of egg white oligopeptide and the four blind sides on memory enhancing in mice. Based on SMG-2 water maze, the length of incubation period in blind-sideⅠ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ in water maze of mice administered intragastrically with high F value oligopeptide from egg white were measured. The results showed that the mice treated with high F value oligopeptide showed significant differences from the control group. Significance test of differences among latent times after a certain time of administration indicated that latent times in mice after 60 days of administration significantly differed from those after fewer days (30, 40 and 50). And mice in blind-side Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ area had a timedependent incubation period upon training, implying that the more complex the maze was, the more intense time-dependent was. While evaluating the memory enhancing ability of egg white oligopeptide, it is better to analyze the incubation period of mice in blind-sideⅠand Ⅱ.

memory enhancement；water maze；blind-side；test time

TS201

A

1002-6630(2011)03-0191-04

2010-05-08

國家“863”計劃項目(2007AA10Z329)

林松毅(1970—)，女，副教授，博士，主要從事功能食品研究與開發(fā)。E-mail：linsongyi730@163.com

*通信作者：劉靜波(1962—)，女，教授，博士，主要從事營養(yǎng)與功能食品研究。E-mail：ljb168@sohu.com