任 旭，陳貴林

唐古特白刺果實(shí)提取物抗氧化活性評(píng)價(jià)

任 旭，陳貴林*

(內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

采用95%乙醇加熱回流提取唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bohr.)果實(shí)成分，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃取。用DPPH自由基法和ABTS+·法進(jìn)行抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，并選取抗壞血酸(VC)和生育酚(VE)作為對(duì)照。結(jié)果顯示乙酸乙酯提取物(EAF)具有較高的抗氧化性，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行硅膠柱層析分離，得到6個(gè)組分(EAF-Ⅰ～EAF-Ⅵ)，其中EAF-Ⅰ和EAF-Ⅳ的抗氧化性均高于VC和VE。白刺果實(shí)提取物具有良好的抗氧化性，有進(jìn)一步開發(fā)為天然抗氧化劑的應(yīng)用前景。

唐古特白刺果實(shí)；DPPH自由基；ABTS+·；抗氧化性；分離提取

生物體在代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基及其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)對(duì)體內(nèi)脂類、蛋白質(zhì)、核酸及糖類等造成的氧化損害是引發(fā)炎癥、心腦血管疾病及心臟疾病的重要因素[1]。同時(shí)，食用油脂、含脂食品和化妝品的酸敗變質(zhì)也與氧自由基氧化有關(guān)。常用抗氧化劑大部分是通過工業(yè)合成或兩步發(fā)酵法生產(chǎn)。由于合成抗氧化劑如BHT (3,5-二叔丁基-4-羥基甲基苯)的毒性問題以及消費(fèi)者對(duì)食品安全性意識(shí)的提高，亟待從自然界中尋找更加安全且活性更強(qiáng)的天然抗氧化劑。研究表明柿子各部分單寧提取物對(duì)·OH、DPPH自由基的清除能力均高于同濃度的葡萄籽提取物[2]，楊梅果核中提取分離到的楊梅素抗氧化活性明顯強(qiáng)于BHT[3]。唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)是內(nèi)蒙古中西部荒漠、半荒漠地區(qū)分布的優(yōu)勢種和建群種之一，也是我國特有品種，其果實(shí)素有“沙漠櫻桃”之美譽(yù)。研究表明，新疆地產(chǎn)唐古特白刺果實(shí)可抑制高脂血癥大鼠血液內(nèi)異常升高的脂質(zhì)過氧化物含量[4]，甘肅地產(chǎn)唐古特白刺果汁對(duì)小鼠全腦MAO-B活性具有一定的抑制作用[5]，而這些研究結(jié)果均基于白刺果實(shí)直接飼喂小鼠所得，對(duì)于其具有活性的成分并未明確。有關(guān)內(nèi)蒙古地區(qū)白刺鮮果中的營養(yǎng)成分已有報(bào)道，如氨基酸含量高于沙棘果實(shí)2～3倍，糖含量約為沙棘的15%[6]，這與白刺通常生長在鹽堿化程度較高的地區(qū)密切有關(guān)。但是對(duì)于白刺果實(shí)中具有抗氧化活性的成分仍未見報(bào)道。本研究采用系統(tǒng)溶劑法對(duì)唐古特白刺果實(shí)進(jìn)行提取，并結(jié)合硅膠柱層析進(jìn)一步分離，以DPPH自由基法和ABTS+·法測定其抗氧化性，以求得到具有較強(qiáng)活性的部位，為開發(fā)新型天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白刺果實(shí)：2008年7月16日于內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市杭錦后旗陜壩鎮(zhèn)(北緯40°46′，東經(jīng)106°47′)采集。經(jīng)內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系陳貴林教授鑒定為唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)。經(jīng)冷凍干燥后，待用。

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸))、Trolox(6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸)、VE 美國Sigma公司；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇均為國產(chǎn)分析純；抗壞血酸 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；柱層析硅膠(200～300目) 青島海洋化工集團(tuán)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津有限公司；BT2202S電子天平 德國Startorius公司；Modulyod-230冷凍干燥機(jī)、Forma -86℃超低溫冰箱 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 抗氧化成分的提取與分離

取白刺果實(shí)干質(zhì)量4.5kg，95%乙醇加熱回流法提取(料液比1:5、提取3次、提取時(shí)間2、1.5、1h)，抽濾、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得乙醇提取物(CEE)1168.93g。將其分散于水中，依次用石油醚﹑氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑提取3次，分別合并萃取液，抽濾、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，分別得到石油醚提取物(PEF) 26.63g、氯仿提取物(CF)25.40g、乙酸乙酯提取物(EAF)44.04g、正丁醇提取物(BF)120.67g、水相(AF) 952.19g。

將所得乙酸乙酯提取物進(jìn)行硅膠柱層析分離(200～300目)。以石油醚:乙酸乙酯體積比為20:1～1:9，然后乙酸乙酯:甲醇體積比為0:1～1:9梯度洗脫，洗脫液進(jìn)行薄層層析色譜法(TLC)檢測，合并相同餾分，得到6個(gè)組分(EAF-Ⅰ～EAF-Ⅵ)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑。

1.3.2 抗氧化活性測定

1.3.2.1 清除DPPH自由基的能力測定

通過測定清除DPPH自由基的能力來測定抗氧化性[7]。25℃恒溫水浴反應(yīng)30min后，在515nm波長處測定吸光度(Ax)，模型對(duì)照組(Ao)用無水乙醇代替供試液?？紤]到供試液本身的光吸收，用無水乙醇代替DPPH自由基溶液作為無自由基反應(yīng)的空白對(duì)照組(Axo)。每個(gè)質(zhì)量濃度組平行測定3次，取其平均值，測定結(jié)果以清除率表示。一般用IC50值，即DPPH自由基的半數(shù)清除率，來衡量不同質(zhì)量濃度的樣品間抗氧化性的比較[8]。IC50的計(jì)算根據(jù)半數(shù)效量概率單位法進(jìn)行。以質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)質(zhì)量濃度清除率的概率單位(probit)為縱坐標(biāo)，求出直線回歸方程，并根據(jù)方程計(jì)算IC50值。DPPH自由基清除率由式(1)計(jì)算得出。

1.3.2.2 清除ABTS+·的能力測定

清除ABTS+·的能力測定參考Re等[9]的方法制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線y=4.5534x+0.8186(R2=0.9978)。結(jié)果用TEAC值表示，即達(dá)到一定質(zhì)量濃度測試物質(zhì)相當(dāng)?shù)目寡趸芰λ枰腡rolox的濃度，單位是mol/g[10]。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS V13.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用x±s表示，多組資料,采用one-way ANOVA分析，組間的比較用Dunnett s檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐古特白刺果實(shí)不同提取物清除DPPH自由基的能力

圖1 DPPH自由基法測定白刺果實(shí)不同提取物的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of extracts from different parts of N. tangutorum fruits determined by DPPH free radical method

DPPH自由基法測定白刺果實(shí)不同部位抗氧化活性是通過DPPH自由基的半數(shù)清除率(IC50)來表示的，即IC50值越小，其抗氧化活性越高。由圖1可知，乙酸乙酯提取物(EAF)的活性在各提取物部位中最強(qiáng)，但小于VC和VE，其IC50值是VC的53倍，VE的26倍。石油醚提取物(PEF)、氯仿提取物(CF)和正丁醇提取物(BF)之間不存在顯著性差異，其中CF的IC50值是VC的68倍和VE的33倍；PEF和BF的IC50值是VC的近100倍，VE的49倍。乙醇提取物(CEE)的抗氧化性顯著高于水相(AF)，其IC50值是VC的176倍、VE的87倍。AF的抗氧化性最弱，其IC50值為(143.03±21.59)mg/mL。結(jié)果表明，EAF具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，其抗氧化性接近于VE，說明唐古特白刺果實(shí)具有開發(fā)為新型天然抗氧化劑的潛能。

EAF提取物經(jīng)柱層析分離所得6個(gè)部位的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明，EAF-Ⅰ和EAF-Ⅳ的抗氧化活性最強(qiáng)，均高于VE。其中EAF-Ⅰ的IC50值僅為(0.08±0.03)mg/mL，是VC的24%、VE的12%；EAF-Ⅳ的抗氧化性介于VC和VE之間，其IC50值是VE的86.6%。EAF-Ⅲ、EAF-Ⅴ和EAF-Ⅵ與VC和VE也不存在顯著性差異，EAF-Ⅲ的IC50值是VC的39倍、VE的19倍；其中EAF-Ⅴ和EAF-Ⅵ的IC50值幾乎相等，是VC的17倍、VE的8倍。EAF-Ⅱ的抗氧化性很弱，其IC50值是VC的99倍、VE的49倍。結(jié)果表明，EAF-Ⅰ的抗氧化活性最強(qiáng)，高于常用合成抗氧化劑VC和VE，可作為新型抗氧化劑的原料應(yīng)用于食品工業(yè)。

2.2 唐古特白刺果實(shí)不同提取物清除ABTS+·的能力

圖2 ABTS+·法測定白刺果實(shí)不同提取物的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of extracts from different parts of N. tangutorum fruits determined by ABTS free radical method

由圖2可知，EAF的活性在各提取物部位中最強(qiáng)，其抗氧化性略高于VE，其余各提取物以及乙醇提取物的抗氧化性均顯著低于EAF、VC和VE。CF的抗氧化性高于其余4個(gè)提取物部位，其TEAC值為VC的39.6%和VE的48.1%。CEE、PEF、BF和AF的TEAC值分別是VC的15.4%、16.4%、16.9%和13.6%，VE的18.6%、19.9%、20.5%和16.5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與DPPH自由基法測定白刺果實(shí)不同部位抗氧化性一致，EAF的抗氧化性與VE相當(dāng)。

EAF經(jīng)柱層析分離純化所得6個(gè)部位的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)表明，EAF-Ⅰ的活性最強(qiáng)，顯著高于VC和VE，其抗氧化性是VC的4倍、VE的5倍。EAF-Ⅳ的抗氧化性略高于VC，顯著高于VE。其余4個(gè)部位的抗氧化性均顯著低于VC和VE。EAF-Ⅴ和EAF-Ⅵ之間不存在顯著性差異，其TEAC值分別是VC的45.1%和40.1%，VE的54.7%和48.7%。EAF-Ⅱ幾乎無活性，TEAC值僅為(1.79±0.97)μmol/g。經(jīng)過二次分離后所得EAF-Ⅰ的抗氧化性是EAF的近5倍。結(jié)果表明，通過柱層析分離，能夠得到抗氧化性極強(qiáng)的部位。EAF-Ⅰ和EAF-Ⅳ的抗氧化性均高于常用抗氧化劑VC和VE，是很好的天然抗氧化劑，其應(yīng)用前景非常廣闊。

3 結(jié) 論

在唐古特白刺果實(shí)的乙醇提取物(CEE)、石油醚提取物(PEF)、氯仿提取物(CF)、乙酸乙酯提取物(EAF)、正丁醇提取物(BF)和水相(AF)中，EAF的抗氧化性最強(qiáng)，其清除ABTS+·能力與VC和VE相當(dāng)。這可能與白刺果實(shí)中含有豐富的多酚類活性物質(zhì)有關(guān)。一般認(rèn)為水果中起抗氧化作用的成分主要是VC，有研究通過對(duì)比15種水果的抗氧化活性與VC含量的關(guān)系，表明其抗氧化活性與VC含量無明顯的相關(guān)關(guān)系[11]。柿子和蓮子殼中含有大量抗氧化成分主要是黃酮類物質(zhì)[12-13]，小漿果藍(lán)莓中的抗氧化成分主要是多酚類物質(zhì)[14]，因此抗氧化活性物質(zhì)大多數(shù)集中在乙酸乙酯萃取物。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過二次分離后所得6個(gè)組分中，其中EAF-Ⅰ和EAF-Ⅳ的抗氧化性均高于VC，但是其余4個(gè)部位的抗氧化活性均低于EAF。櫻桃化學(xué)成分相互影響作用機(jī)理的研究[15]表明化學(xué)成分之間的互相影響也是很復(fù)雜的，因此，尋求具有強(qiáng)抗氧化活性的部位更加具有應(yīng)用價(jià)值。研究結(jié)果表明EAF-Ⅰ和EAF-Ⅳ的抗氧化性均高于常用合成抗氧化劑VC和VE，這對(duì)于開發(fā)荒漠野生水果提供了理論依據(jù)。因此，唐古特白刺果實(shí)提取物作為新型天然抗氧化劑的原料，將在食品工業(yè)和化妝品行業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Antioxidant Activity of Extracts from Nitraria tangutorum Bohr. Fruits

REN Xu，CHEN Gui-lin*
(College of Life Science, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China)

Nitraria tangutorum Bohr. fruits were extracted using 95% ethanol, and then the extract was partitioned with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol successively. The antioxidant activities of different fractions were evaluated by scavenging capability of ABTS+and DPPH free radicals, and compared with the antioxidant activities of ascorbic acid (vitamin C) and tocopherol (vitamin E). Results indicated that ethyl acetate fraction (EAF) exhibited the highest antioxidant activity. EAF was further fractionated into 6 fractions by silica gel column chromatography. The antioxidant activities of EAFI and EAF-IV were higher than those of vitamin C and vitamin E. Therefore, N. tangutorum fruit extracts have excellent antioxidant activities, and have promising application prospects as a natural antioxidant.

Nitraria tangutorum Bohr. fruit；DPPH free radical；ABTS+free radical；antioxidant activity；separation and purification

TS255.1

A

1002-6630(2011)03-0095-03

2010-05-13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30660015)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(20091501110002)；

內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導(dǎo)獎(jiǎng)勵(lì)資金(2010年度)資助項(xiàng)目

任旭(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幱弥参锘瘜W(xué)。E-mail：rrenxu@163.com

*通信作者：陳貴林(1961—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)樗幱弥参锘瘜W(xué)。E-mail：guilinchen@yahoo.com.cn