劉新雨，曾新安，賈 曉

脈沖電場對荔枝汁中釀酒酵母的殺滅效果

劉新雨，曾新安*，賈 曉

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

研究不同電場強度和處理時間的脈沖電場(PEF)對荔枝汁中釀酒酵母菌的殺滅效果，并探討能量輸入對釀酒酵母殺滅效果的影響。結(jié)果顯示：電場強度的增大和處理時間的延長均能增大釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)；對不同生長時期釀酒酵母進(jìn)行殺菌，表明荔枝汁中處于4個不同生長時期的釀酒酵母對電場敏感度不同，由強到弱依次為穩(wěn)定期＞對數(shù)期＞衰亡期＞調(diào)整期。PEF對釀酒酵母的滅菌效果隨著電場能量輸入的增加而增強。

高強脈沖電場；荔枝汁；滅菌

荔枝作為四大“嶺南佳果”之一，味甜鮮美、汁多肉嫩、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者的喜愛，具有一定的藥效和滋補作用。但是由于荔枝生產(chǎn)地域集中、采摘期短，對新鮮荔枝進(jìn)行即時深加工具有重要意義[1]。荔枝汁作為加工產(chǎn)品的一種形式，如果不經(jīng)過合適的處理將很容易變質(zhì)[2]。然而，荔枝汁熱敏性很強，普遍認(rèn)為不適合熱滅酶、熱殺菌等熱處理工藝。

高強脈沖電場(pulsed electric field，PEF)技術(shù)是一種正在興起的非熱加工技術(shù)，具有非熱(低溫)高效連續(xù)殺滅微生物的特點，對食品天然營養(yǎng)、風(fēng)味等影響較小[3-5]，能符合果汁滅菌要求[6-10]。因此PEF技術(shù)能夠較好地保存果汁的營養(yǎng)物質(zhì)，延長果汁的保存期[11]，具有廣泛的應(yīng)用前景。國外已有工業(yè)規(guī)模果蔬汁電場滅菌方面的研究[11]。本實驗主要研究高強脈沖電場對荔枝汁中釀酒酵母的滅菌效果，初步探討電場能量輸入、滅菌效果和荔枝汁處理過程中溫度升高之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

荔枝汁由廣東省帝濃酒業(yè)有限公司提供，冷藏貯存，實驗時經(jīng)高速冷凍離心機(jī)離心，取上清液備用；釀酒酵母菌種由華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院微生物實驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

麥芽瓊脂培養(yǎng)基(麥芽膏粉130g/L、瓊脂15g/L、氯霉素0.1g/L) 廣東環(huán)凱生物科技有限公司；氯化鈉(分析純) 天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.3 儀器與設(shè)備

721 型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HHS電熱恒溫水浴鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋 上海滬南科學(xué)儀器廠；高強脈沖電場連續(xù)處理裝置(主要由示波器、脈沖發(fā)生器、處理室、負(fù)載電阻、恒流泵組成。脈沖電場參數(shù)為：電場強度0～35kV/cm 連續(xù)可調(diào)，脈沖頻率為1.0kHZ，脈沖寬度25μs。處理室電極材料為不銹鋼，絕緣部分為聚四氟乙烯，容量為0.02mL，波形為平方波) 華南理工大學(xué)脈沖電場研究組自行設(shè)計開發(fā)。

1.4 方法

不同生長環(huán)境及不同培養(yǎng)基都會對釀酒酵母生長有一定的影響。為了研究PEF對荔枝汁中處于各個生長時期的釀酒酵母的滅菌效果，實驗首先對釀酒酵母在荔枝汁中的生長情況進(jìn)行測定。

1.4.1 菌種生長曲線的測定

1.4.1.1 菌種的恢復(fù)培養(yǎng)

凍干菌種裝在小試管內(nèi)，用劃線法將菌種轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。30℃恒溫培養(yǎng)48h，使菌種復(fù)壯。

1.4.1.2 擴(kuò)大培養(yǎng)

在培養(yǎng)好的試管中加入無菌液體培養(yǎng)基，用無菌接種環(huán)將斜面上的菌落剝離，搖勻，制成菌懸液，接種到無菌的容量為1L并裝有300mL 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在30℃、180r/min 振蕩培養(yǎng)20h，此時培養(yǎng)液渾濁。

1.4.1.3 生長曲線的測定

將分光光度計波長調(diào)整到560nm，預(yù)熱30min。以未接種的荔枝汁培養(yǎng)液校正零點。取盛有300mL 無菌荔枝汁培養(yǎng)液的1000mL錐形瓶1個，加入振蕩培養(yǎng)20h的細(xì)菌培養(yǎng)液30mL，30℃恒溫培養(yǎng)。于培養(yǎng)后的36h內(nèi)每隔2 h用無菌移液管從瓶中吸取培養(yǎng)液樣，在波長560nm處測定OD值。

1.4.2 滅菌效果測定

采用混合平板培養(yǎng)法于36℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并計算PEF處理前后荔枝汁中的活菌總數(shù)。滅菌效果采用菌數(shù)減少指數(shù)表示。

式中：N為脈沖電場處理后的菌落總數(shù)/(CFU/mL)；N0為脈沖電場處理前的菌落總數(shù)/(CFU/mL)。

1.4.3 PEF能量輸入計算

脈沖個數(shù)以及總處理時間的計算見公式(2)、(3)[12-13]。

式中：n為脈沖個數(shù)；t為總處理時間；V為處理室體積/mL；f為脈沖頻率/Hz；u為流速/(mL/s)；τ為脈沖持續(xù)時間/μs。

電場輸入能量計算見公式(4)[14-16]為：

式中：Q為輸入能量/(J/m3)；E為電場強度/(V/m)；為一定溫度下樣品的電導(dǎo)率/(S/m)；t為總處理時間/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝汁中釀酒酵母的生長曲線

圖1 釀酒酵母在荔枝汁中的生長曲線Fig.1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae in litchi juice

由圖1可以看出，釀酒酵母在荔枝汁中培養(yǎng)0～10h內(nèi)，生長緩慢，處于調(diào)整期。隨后進(jìn)入對數(shù)生長期，曲線呈快速上升趨勢。培養(yǎng)28h時菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期。然后在很短時間內(nèi)由穩(wěn)定期進(jìn)入衰亡期，生長曲線急劇下降。本實驗以荔枝汁中培養(yǎng)釀酒酵母菌5、20、30、35h分別代表荔枝汁中釀酒酵母生長的4個不同時期。

2.2 PEF對荔枝汁中處于穩(wěn)定期的釀酒酵母滅菌效果

PEF對微生物的作用效果影響因素較多，其中最重要的因素是電場強度和處理時間。實驗首先以這兩個因素對滅菌效果的影響進(jìn)行探討。

脈沖電場強度為3、7、10、13、17、20kV/cm，處理時間為1000、750、600μs時不同電場強度不同處理時間條件下脈沖電場對荔枝汁中處于穩(wěn)定期(荔枝汁中培養(yǎng)30h)的釀酒酵母滅菌效果見圖2。

圖2 不同電場強度和不同處理時間對荔枝汁中處于穩(wěn)定期的釀酒酵母的滅菌效果Fig.2 Sterilization effect of PEF treatment at various intensities and treatment time on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice

由圖2可以看出，隨著電場強度的升高，釀酒酵母菌數(shù)減少指數(shù)增大。處理時間延長，菌數(shù)減少指數(shù)也不斷增大。當(dāng)電場強度為20kV/cm、處理時間為1000μs時，PEF處理后釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)達(dá)到4.13?？梢?，在本實驗范圍內(nèi)，隨著電場強度的增強和處理時間的延長，PEF對荔枝汁中的釀酒酵母的滅菌效果更加明顯。

2.3 高強脈沖電場對荔枝汁中處于不同生長期的釀酒酵母的滅菌效果

釀酒酵母處于不同的生長期對滅菌效果也會產(chǎn)生影響，將荔枝汁中培養(yǎng)釀酒酵母5、20、30、35h分別代表釀酒酵母生長的4個不同時期進(jìn)行如下實驗研究。由圖3可看出，PEF對荔枝汁中處于穩(wěn)定期的釀酒酵母菌數(shù)減少指數(shù)最大，滅菌效果最好。其他3個時期滅菌效果依次為對數(shù)期＞衰亡期＞調(diào)整期。結(jié)果說明，

圖3 不同電場強度對荔枝汁中處于各個生長期的釀酒酵母的滅菌效果Fig.3 Sterilization effect of PEF treatment at various intensities on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice during different growth phases

處于穩(wěn)定期的釀酒酵母對電場最為敏感。盡管脈沖電場的殺菌機(jī)理目前尚不確定，但其中被大家普遍認(rèn)同的電崩解理論和電穿孔原理均認(rèn)為在外加電場作用下，微生物的細(xì)胞膜發(fā)生了一定的改變，最終導(dǎo)致微生物的死亡[17-19]。釀酒酵母處于穩(wěn)定期時，由于荔枝汁中營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，各種代謝產(chǎn)物的不斷積累，細(xì)胞膜更容易受到電場的影響，從而使得PEF對穩(wěn)定期的釀酒酵母的滅菌效果最好。

2.4 高強脈沖電場不同能量輸入對處于穩(wěn)定期的釀酒酵母的滅菌效果

圖4 不同電場輸入能量對荔枝汁中穩(wěn)定期釀酒酵母的滅菌效果Fig.4 Sterilization effect of PEF treatment at various energy inputs on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice during stable growth phase

通過公式(4)計算不同的電場強度及處理時間時的電場輸入能量，從能量的角度考察PEF對釀酒酵母的滅菌效果。

由圖4可以看出，隨著電場輸入能量的增加，PEF對荔枝汁中的穩(wěn)定期釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)不斷增加，滅菌效果越來越好。通過線性擬合可知，電場輸入的能量和菌數(shù)減少指數(shù)具有一定的線性關(guān)系即y= 0.0018x+2.0482，線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9794。當(dāng)輸入的能量由15.16J/mL升至1123.12J/mL時，PEF對釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)相應(yīng)由2.15提高到了4.13。

2.5 PEF不同輸入能量對各生長期釀酒酵母滅菌效果

圖5 不同電場輸入能量對荔枝汁中處于各個生長期的釀酒酵母的滅菌效果Fig.5 Sterilization effect of PEF treatment at various energy inputs on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice during different growth phases

由圖5可以明顯看出，荔枝汁中處于4個生長期的釀酒酵母均隨著電場輸入能量的增加菌數(shù)減少指數(shù)增大。處于4個不同生長時期的釀酒酵母對能量敏感度由強到弱分別是穩(wěn)定期＞對數(shù)期＞衰亡期＞調(diào)整期，實驗結(jié)果類似于2.3節(jié)。

2.6 PEF輸入能量與荔枝汁溫度之間的關(guān)系

處于各個生長期的釀酒酵母均隨著能量輸入的增大，滅菌效果增加。但是由于能量輸入增大會相應(yīng)導(dǎo)致荔枝汁溫度的不斷升高。所以實驗取處理時間為600μs，以PEF對穩(wěn)定期釀酒酵母滅菌過程建立輸入能量與荔枝汁樣液溫度的關(guān)系。

表1 高強脈沖電場輸入能量與荔枝汁溫度升高之間的關(guān)系Table 1 Relationship of PEF energy input and temperature in litchi juice

如表1所示， PEF對荔枝汁的滅菌過程中隨著電場強度的不斷增加，電場輸入能量不斷增加，荔枝汁溫度升高值也不斷增加。當(dāng)電場強度為20kV/cm時，溫度升高了30℃，菌數(shù)減少指數(shù)達(dá)到了3.30。雖然處理過程中荔枝汁的溫度升高比起熱處理過程比較小，但是仍可能導(dǎo)致荔枝汁風(fēng)味的改變。所以可以考慮調(diào)整荔枝汁處理時的流速和電場，如增大電場強度同時增大處理時間，或者在一定處理時間下減小電場強度，達(dá)到要求的滅菌效果。

3 結(jié) 論

PEF對于荔枝汁中的釀酒酵母具有明顯的殺菌效果。在電場強度為20kV/cm，處理時間為1000μs，時釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)達(dá)到4.13。

荔枝汁中處于4個不同生長時期的釀酒酵母對電場敏感程度不同，由強到弱依次為穩(wěn)定期＞對數(shù)期＞衰亡期＞調(diào)整期。可以看出PEF對荔枝汁中處于穩(wěn)定期的釀酒酵母殺菌效果最好。

電場強度的增大以及處理時間的延長均使電場輸入的能量增加。實驗結(jié)果顯示，隨著電場輸入能量的增加，釀酒酵母的菌數(shù)減少指數(shù)增加，即滅菌效果越來越好。電場輸入能量的增加導(dǎo)致處理時荔枝汁溫度的不斷升高。當(dāng)電場強度為20kV/cm處理時間為600μs時，溫度升高了30℃，菌數(shù)減少指數(shù)達(dá)到3.30。

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Sterilization Effect of Pulsed Electric Field on Saccharomyces cerevisiae in Litchi Juice

LIU Xin-yu，ZENG Xin-an*，JIA Xiao
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The sterilization effect of pulsed electric field (PEF) treatment on Saccharomyces cerevisiae in litchi juice was investigated. Results indicated that the lethality of Saccharomyces cerevisiae treated by PEF was increased as the increase of electric field strength and pulsed treatment time. The survival microorganisms exhibited a reduction of 104folds when subjected to the pulsed electric field treatment at 20 kV/min for 1000μs. The sensitivity of PEF treatment during different growth phase of Saccharomyces cerevisiae exhibited an order from strong to weak as stable phase, logarithmic phase, decline phase and adjustment phase. A better sterilization effect of PEF treatment was also observed at the condition of enhanced energy input.

high-intensity pulsed electric field；litchi juice；sterilization

TS255.44

A

1002-6630(2011)03-0091-04

2010-04-29

廣東省國際合作項目(2009B050400003)；廣東省自然科學(xué)基金項目(9151008901000159)

劉新雨(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為脈沖電場對食品成分的影響。

E-mail：liuxinyu228@yahoo.com.cn

*通信作者：曾新安(1972—)，男，教授，博士，研究方向為食品綠色加工。E-mail：xazeng@scut.edu.cn