仇益民,汪 萍,李其華,馮志明，閻政禮，雷春華

（1.長(zhǎng)沙市開福區(qū)人民醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410005；湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410081）

1977年,Halman首先將化學(xué)發(fā)光應(yīng)用于免疫分析,創(chuàng)建了化學(xué)發(fā)光免疫分析，目前它已成為發(fā)展最快和應(yīng)用廣泛的免疫分析方法。與傳統(tǒng)的放射免疫分析RIA比較，化學(xué)發(fā)光免疫分析不需建立昂貴的放射性同位素實(shí)驗(yàn)室，沒有放射性污染,不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生損害,且操作簡(jiǎn)便。與酶聯(lián)免疫分析ELISA比較，化學(xué)發(fā)光免疫分析不僅靈敏度高,而且能較好進(jìn)行定量免疫分析與檢測(cè)。

辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)是增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析常用的標(biāo)記體系,因其具有高轉(zhuǎn)換系數(shù)、對(duì)不同靈敏度分析系統(tǒng)的適應(yīng)性及適用不同的聯(lián)接方法和相對(duì)分子量小等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。魯米諾luminol是HRP催化氧化發(fā)光的常用底物。如果不使用增強(qiáng)劑,魯米諾體系的發(fā)光基本上為閃光型,且信號(hào)弱、靈敏度低。但通過加入增強(qiáng)劑,可使發(fā)光時(shí)間明顯延長(zhǎng),使其從短暫的閃光型改進(jìn)為持續(xù)30 min至數(shù)小時(shí)甚至更久的輝光型，明顯增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度和提高信噪比、靈敏度，簡(jiǎn)化操作和測(cè)量方法[1]。用于HRP酶促化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)劑非常廣泛,包括熒光素、取代酚、對(duì)羥基聯(lián)苯、芳香胺、取代硼酸和靛酚等[1,2]。

本文擬合成N-酚噻嗪丙磺酸，探討N-酚噻嗪丙磺酸對(duì)HRP-Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光的增強(qiáng)特性，并用于HRP含量的測(cè)定。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠 ；pHS-25型酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Avance-500 FT-NMR譜儀瑞士Bruker公司，TMS為內(nèi)標(biāo)，D2O為溶劑,耦合常數(shù)(J)以Hz為單位；Nicolet-550 FT-IR型紅外光譜儀 美國(guó)Nicolet公司 溴化鉀壓片；PE-2400元素分析儀 美國(guó)PE公司；LKB-1250發(fā)光光度計(jì)(瑞典)。

酚噻嗪、1,3-二溴丙烷、魯米諾和辣根過氧化物酶(美國(guó)Sigma公司)；其它化學(xué)試劑均為分析純。層析硅膠粉(青島海洋化工廠)200-300目。

1.2 N-酚噻嗪丙磺酸的合成

9.2 g (0.05 mol)酚噻嗪溶于30 mL無水四氫呋喃，緩慢加入2.4 g 0.1 mol NaH溶于30 mL無水四氫呋喃，在避光、N2保護(hù)和50℃下攪拌反應(yīng)2 h制得酚噻嗪N鈉鹽。冷至室溫后，緩慢滴入10.1 g 0.1 mol 1,3-二溴丙烷 溶于30 mL無水四氫呋喃，在避光、N2保護(hù)和室溫下攪拌反應(yīng)24 h。濾除殘?jiān)蟮姆磻?yīng)液經(jīng)真空濃縮所得固體經(jīng)硅膠 (200-300目)柱層析分離正己烷-苯為洗脫液。洗脫液真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇重結(jié)晶2次，60℃真空干燥24 h得5.1 g暗綠色色固體化合物N-酚噻嗪溴丙烷收率33.5%。N-酚噻嗪溴丙烷溶于10 mL四氫呋喃，加入適量飽和亞硫酸氫鈉溶液，避光攪拌回流反應(yīng)4 h。減壓回收四氫呋喃，真空濃縮所得固體經(jīng)乙醇重結(jié)晶制得N-酚噻嗪丙磺酸鈉。

1.3 HRP-Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光體系

將適量的N-酚噻嗪丙磺酸溶液(3.43 mg溶于1 mL pH 8.5 T ris緩沖液)、辣根過氧化物酶溶液(用 pH 8.5 Tris緩沖液稀釋至 1×10-7g/L和 3.0 mmol/L H2O2溶液加入到測(cè)定管中,再加入適量魯米諾溶液 17.7 mg溶于1 mL pH 8.5 Tris緩沖液后在發(fā)光光度計(jì)中測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 N-酚噻嗪丙磺酸的結(jié)構(gòu)表征

N-酚噻嗪丙磺酸鈉的收率65.6%3.6 g。1H NMR(D2O/TMS)δ:2.0(t,2H,-CH2CH2CH2SO3Na),2.5 (t,2H,CH2N),4.0 (t,2H,CH2N),6.5-7.6(m,8H, PhCH2).IR (KBr) : 3058, 2985, 1630, 1589，1456，1106，643 cm-1。N-酚噻嗪丙磺酸鈉(C15H14NS2O3Na)的元素分析結(jié)果 (計(jì)算值):C 52.45(52.50),H 4.12(4.17),N 3.92 4.08。

2.2 N-酚噻嗪丙磺酸對(duì)HRP-Luminol-H2O2酶促發(fā)光的增強(qiáng)作用

在HRP-Luminol-H2O2反應(yīng)體系 1.0×10-8g/L HRP,0.01 mmol/L Luminol,0.3 mmol/L H2O2中,無增強(qiáng)劑時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度低，且持續(xù)時(shí)間僅為數(shù)秒至十幾秒。加入1.0×10-3mmol/L N-酚噻嗪丙磺酸對(duì)可以顯著地增強(qiáng)HRP酶催化的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，延長(zhǎng)發(fā)光可持續(xù)約30 min以上,之后緩慢衰減 表1，說明N-酚噻嗪丙磺酸對(duì)HRP-Luminol-H2O2反應(yīng)體系的發(fā)光具有顯著的增強(qiáng)作用。加入N-酚噻嗪丙磺酸后，克服了傳統(tǒng)的HRP-Luminol-H2O2反應(yīng)體系瞬時(shí)發(fā)光,發(fā)光強(qiáng)度低，持續(xù)時(shí)間短，不易準(zhǔn)確測(cè)量等弱點(diǎn)[3-4]。

表1 N-酚噻嗪丙磺酸對(duì)HRP-Luminol-H2O2酶促發(fā)光的增強(qiáng)效應(yīng)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度

2.3 N-酚噻嗪丙磺酸的濃度對(duì)HRP-Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光的影響

在HRP-Luminol-H2O2反應(yīng)體系 1.0×10-8g/L HRP，0.01 mmol/L Luminol，0.3 mmol/L H2O2中,依次加入不同劑量的N-酚噻嗪丙磺酸，記錄30 s時(shí)的發(fā)光強(qiáng)度表2。N-酚噻嗪丙磺酸濃度在0.5-64 mmol/L范圍內(nèi)，顯示較好的增強(qiáng)效果。在HRP濃度為1.0× 10-8g/L時(shí)，加入1.0×10-3mmol/L N-酚噻嗪丙磺酸即可獲得理想的增強(qiáng)效果。也提示在酶濃度更低時(shí)可適當(dāng)選擇較高濃度的增強(qiáng)劑，以提高檢測(cè)的靈敏度。

表2 N-酚噻嗪丙磺酸的濃度對(duì)HRP-Luminol-H2O2酶促發(fā)光的作用

2.4 對(duì)HRP酶含量的測(cè)定

HRP采用0.1%BSA溶液應(yīng)用對(duì)數(shù)稀釋法,濃度依次為每mL含1600,800,400,200,100,50, 25 pg。在HRP-Luminol-H2O2反應(yīng)體系 0.01 mmol/ L Luminol，0.3 mmol/L H2O2中,依次遞增辣根過氧化物酶含量,30 s秒記錄得到發(fā)光值 表3。

表3 酶濃度對(duì)HRP-Luminol-H2O2酶促發(fā)光的作用

在發(fā)光體系中加入N-酚噻嗪丙磺酸，酶含量在25-800 pg/mL范圍內(nèi)HRP含量與發(fā)光相對(duì)強(qiáng)度顯示良好的線性關(guān)系，可顯著降低最低檢測(cè)限量，提高檢測(cè)靈敏度。

3 討 論

HRP標(biāo)記抗體方法成熟穩(wěn)定,用于增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中具有樣品用量少,反應(yīng)時(shí)間短,發(fā)光強(qiáng)度大,無污染等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用廣泛。

在HRP-Luminol-H2O2反應(yīng)體系中加入N-酚噻嗪丙磺酸后，其最大發(fā)射波長(zhǎng)仍為425 nm處，與文獻(xiàn)報(bào)道HRP-Luminol-H2O2反應(yīng)體系發(fā)光光譜相同。說明N-酚噻嗪丙磺酸沒有改變HRP酶促發(fā)光反應(yīng)的歷程,可能是增強(qiáng)劑直接或間接加速了發(fā)光反應(yīng)的一步或多步復(fù)合物形成的過程。催化反在HRP-Luminol-H2O2反應(yīng)體系中，增強(qiáng)劑N-酚噻嗪丙磺酸的使用從其穩(wěn)定性及增強(qiáng)發(fā)光作用等都顯示出較好的性質(zhì),經(jīng)多次試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)變異現(xiàn)象,重復(fù)性好。不同于酚類有機(jī)增強(qiáng)劑[5]，N-酚噻嗪丙磺酸易溶于水，使用方便，在靈敏度、精密度和準(zhǔn)確性等表現(xiàn)了較好的優(yōu)越性,有望應(yīng)用于HRP及其標(biāo)記物的發(fā)光檢測(cè)如ELISA和West-blotting等免疫分析中。

[1]Sánchez FG,Díaz AN,Bracho V,et al.Automated determination of asulam by enhanced chemiluminescence using luminol/peroxidase system [J].Luminescence,2009,24(6): 448-52.

[2]舒立濤,徐寶順,張培因.增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法建立及測(cè)定血清中的胃泌素 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2006,10 (1):96-97.

[3]Minekawa T,Ohkuma H,Abe K,et al.Development of ultra-high sensitivity bioluminescent enzyme immunoassay for hepatitis B virus surface antigen using firefly luciferase [J].Luminescence,2009,24(6):394-399.

[4]Alpeeva IS,Yu Sakharov I.Luminol-hydrogen peroxide chemiluminescence produced by sweet potato peroxidase [J].Luminescence,2007,22 2:92-96.

[5]Xin TB,Chen H,Lin Z,et al.A secondary antibody format chemiluminescence immunoassay for the determination of estradiol in human serum[J].Talanta,2010,82(4):1472-1477.