肖 遐，何麗華

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖南 長沙 410013）

四季感冒膠囊由桔梗、陳皮、荊芥、連翹等九味中藥組成。具有清熱解表，用于四季風(fēng)寒感冒，特別適用于體弱者、妊娠婦女因感冒引起的發(fā)熱、頭痛，鼻流清涕、咳嗽口干，咽喉疼痛、惡心厭食等癥狀。為了更好的控制本品的質(zhì)量，本文采用高效液相色譜法（HPLC）測定陳皮中橙皮苷的含量。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定的檢測方法分離度高，重現(xiàn)性好，陰性無干擾，方法可行。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀；TL9900數(shù)據(jù)處理軟件。日本SHIMADZU CIV-240IPC紫外分光光度計(jì)；BP211D電子分析天平 （西德Sartorious）；精密度試紙。試劑：甲醇均為色譜試劑，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

1.2 試藥

四季感冒膠囊自制。橙皮苷為中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，批號(hào)721- 200810。

2 鑒別實(shí)驗(yàn)

2.1 連翹

取本品的內(nèi)容物4g,加醋酸乙酯20mL,超聲處理30 min,濾過,濾液置水浴上蒸干,殘?jiān)蛹状?mL使溶解,作為供試品溶液。另取除連翹外的其余處方量藥材，按制備工藝制成陰性樣品，同上法制成缺連翹的陰性溶液。再取連翹對(duì)照藥材0.5g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述三種溶液各10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇（10:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃烘約10 min。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。缺連翹的陰性溶液無干擾。

2.2 荊芥

另取除荊芥外的其余處方量藥材，按制備工藝制成陰性樣品，同上法制成缺荊芥的陰性溶液。再取荊芥對(duì)照藥材0.8g，加乙醚20 mL，置水浴上加熱回流15 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)哟姿嵋阴?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。吸取上述對(duì)照藥材溶液、陰性溶液及鑒別（3）項(xiàng)下的供試品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正已烷-醋酸乙酯（17：3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 5%香草醛硫酸溶液，在105℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。缺荊芥的陰性溶液無干擾。

2.3 陳皮

取本品的內(nèi)容物4g,置索氏提取器中,加石油醚(60～90℃)20mL，加熱回流 2 h，棄去石油醚，藥渣揮干，加甲醇20mL，再加熱回流至提取液無色，提取液置水浴上蒸至約5mL，作為供試品溶液[1]；另取除陳皮外的其余處方藥材，按制備工藝制成陰性樣品，同上法缺陳皮的陰性溶液；再取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液；取上述三種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，依次用醋酸乙酯-甲醇-水（100:17:13）及甲苯-醋酸乙酯-甲酸-水（20:10:1:1）上層液作二次展開，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。缺陳皮的陰性溶液無干擾。

3 含量測定

方中陳皮主含橙皮苷，中檢所已提供用于含量測定用的對(duì)照品。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，橙皮苷的含量測定方法可采用薄層掃描法及高效液相色譜法等[2]，參照《中國藥典》2008年版一部陳皮中橙皮苷的含量測定方法[3]，采用HPLC法測定本品中橙皮苷的含量，并進(jìn)行方法學(xué)研究。經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，缺陳皮的陰性溶液無干擾，且樣品分離效果好。測定十批成品，其平均含量為1.12mg/粒，考慮大生產(chǎn)中的損耗等問題，并參照十批成品實(shí)測平均含量，按70%折算，暫定本品限度為每粒中含橙皮苷不得少于0.8mg。經(jīng)方法學(xué)考察結(jié)果表明，本測定方法基本可行，其方法學(xué)考察及結(jié)果如下。

3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

色譜柱選擇：采用 C18（Polaris 150×4.6mm，5μ）色譜柱，流動(dòng)相選擇：甲醇-醋酸-水（35:4:61）為流動(dòng)相，供試品色譜中橙皮苷能與其他組分峰達(dá)到完全基線分離，它相鄰色譜峰分離度大于1.5，測得峰面積最大。測定波長的選擇：分別取橙皮苷對(duì)照品液和流動(dòng)相，在紫外分光光度計(jì)上，于200～500 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果橙皮苷在283nm±1 nm波長處有最大吸收。故選擇283nm為測定波長。柱溫：35。C。流速：1.0mL/min。進(jìn)樣量：5μL。理論塔板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。同時(shí)取缺陳皮的陰性溶液進(jìn)樣測定，試驗(yàn)結(jié)果表明，陰性溶液色譜圖中在與橙皮苷對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置上無干擾峰。

3.2 供試品溶液的制備

參照中國藥典2008年版一部陳皮含量測定項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制定本品的供試品溶液的制備方法如下：

取本品裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物，精密稱定，研細(xì)，取約0.8g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）80 mL，加熱回流 2-3 h，棄去石油醚，藥渣揮干，加甲醇70 mL，再加熱回流至提取液無色，提取液置水浴上蒸至約40 mL，放冷，濾過，濾液置50 mL量瓶中，用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗滌液濾入同一量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.3 陰性溶液的制備

取除陳皮外的其余處方量藥材，按制備工藝方法制備缺陳皮的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成缺陳皮的陰性溶液。

3.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取橙皮苷對(duì)照品5.39mg，置100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（0.0539mg/mL）。

3.5 測定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性溶液與供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

3.6 線性關(guān)系考察

精密吸取濃度為0.0539mg/mL的橙皮苷對(duì)照品溶液 1、3、5、7、9μL 進(jìn)樣，測定其峰面積積分值，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：A= 38223991.6C-12337.7，r=0.9999。結(jié)果表明橙皮苷在0.0539～0.4851μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果表

3.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（ 20080602）5μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定其峰面積積分值，峰面積平均為 95572006，RSD=0.7%(n=5)結(jié)果表明：儀器精密良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果表

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液（ 20080602）5μl，于 0、2、4、8、12 小時(shí)進(jìn)樣，測定其峰面積積分值，結(jié)果表明，避光保存的供試品溶液，橙皮苷峰面積平均為 10214753，RSD=0.871%(n=5),表明供試品溶液應(yīng)避光保存,在此條件下 12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表

3.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（ 20080602）按上述條件，測定5次，結(jié)果橙皮苷平均含量為1.233mg/粒,RSD=1.34%(n=5),結(jié)果表明本法重現(xiàn)性好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表

3.10 回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量為 1.233mg/粒（ 20080602批，3.597mg/g）的樣品0.4g，分別精密加入橙皮苷對(duì)照品溶液（0.1512mg/mL）10.0mL，即 1.512mg，按上述含量測定項(xiàng)下的方法測定含量，結(jié)果橙皮苷平均加樣回收率為98.04%，RSD=0.8%（n=5）。表明本方法加樣回收率好。（樣品進(jìn)樣量約為0.26μg，均在線性范圍內(nèi)）

表5 回收率測定結(jié)果表

3.11 十樣品測定與結(jié)果

按擬定的含量測定方法測定十批樣品中橙皮苷的含量，結(jié)果上述十批樣品的平均含量1.12 mg/粒，考慮到大生產(chǎn)中的損耗等問題，暫定本品每粒含陳皮按橙皮苷不得少于0.8 mg。

按擬定的含量測定方法測定十批樣品中橙皮苷的含量，結(jié)果見表6。

表6 十批樣品含量測定結(jié)果表

3 討論

色譜柱選擇：采用C18（Polaris 150×4.6mm，5μ）色譜柱，流動(dòng)相選擇：甲醇-醋酸-水（35:4:61）為流動(dòng)相，供試品色譜中橙皮苷能與其他組分峰達(dá)到完全基線分離，它相鄰色譜峰分離度大于1.5，測得峰面積最大。測定波長的選擇：分別取橙皮苷對(duì)照品液和流動(dòng)相，在紫外分光光度計(jì)上，于200～500 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果橙皮苷在283nm±1 nm波長處有最大吸收。故選擇283nm為測定波長。同時(shí)取缺陳皮的陰性溶液進(jìn)樣測定，試驗(yàn)結(jié)果表明，陰性溶液色譜圖中在與橙皮苷對(duì)照品色譜峰相應(yīng)位置上無干擾峰。

[1]王寶琴,主編.中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究 [M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,1994.

[2]王喜軍,編著.高效液相色譜在中藥研究中的應(yīng)用[M].黑龍江：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社,1994.

[3]衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中國藥典 .一部[M].北京：北京化學(xué)工業(yè)出版社,2008.附錄VIB.