易芳芳,龔 建，朱秀娟，向 真，袁云香，賀麗萍

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410006）

睪丸生精細(xì)胞凋亡是生精過(guò)程中產(chǎn)生的一種生理現(xiàn)象，隱睪由于生精細(xì)胞的過(guò)度凋亡而使生精功能低下，甚至導(dǎo)致不育。隱睪所致的生精細(xì)胞過(guò)度凋亡與活性氧所致的過(guò)氧化有關(guān)。原花青素是一種良好的氧游離基清除劑和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制劑，可有效清除超氧陰離子自由基和羥基自由基，也參與磷脂、花生四烯酸的新陳代謝和蛋白質(zhì)磷酸化，保護(hù)脂質(zhì)不發(fā)生過(guò)氧化損傷[1，2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬隱睪模型，探討原花青素對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性隱睪生精細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型的建立及處理

40只健康雄性SD大鼠 (42日齡，體重120～160g)，購(gòu)自湖南農(nóng)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。喂養(yǎng)7天后，隨機(jī)分為隱睪+原花青素(低、中、高劑量組分別按300,450,600 mg/kg，稀釋至 5mL，)組、隱睪+生理鹽水組 （生理鹽水5 mL）、假手術(shù)組。巴比妥鈉(50mg/Kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，下腹正中切口，假手術(shù)組將左側(cè)睪丸切斷引帶后還納入陰囊關(guān)腹。其他五組大鼠切斷左側(cè)睪丸引帶后，用5-0尼龍線將左側(cè)睪丸固定于腹后壁后關(guān)腹。術(shù)后隱睪+生理鹽水組及隱睪+原花青素(高、中、低劑量)組分別灌胃給予生理鹽水和原花青素，每天三次，定時(shí)定量灌胃，7天后快速脫頸椎法處死所有大鼠，雙側(cè)睪丸稱濕重，之后置4%多聚甲醛中固定。

1.2 主要試劑

原花青素為紅棕色粉末(南京澤朗醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司)，純度95% ，臨用時(shí)用30℃溫水配置成混懸液。DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程公司。

1.3 TUNEL法檢測(cè)

4%多聚甲醛固定睪丸，常規(guī)脫水，透明，包埋。將已固定的各組睪丸常規(guī)組織切片，厚度5 μm，裱于用多聚賴氨酸處理的載玻片上烤干備用。每個(gè)蠟塊取部分切片常規(guī)H.E染色，并取部分切片作TUNEL原位末端標(biāo)記，步驟按細(xì)胞凋亡試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DAB顯色，光鏡觀察。

1.4 結(jié)果判定

TUNEL法：光鏡下凋亡細(xì)胞的胞核呈棕褐色，陰性對(duì)照用磷酸緩沖液代替DNA末端轉(zhuǎn)移酶。每個(gè)睪丸組織切片隨機(jī)觀察10個(gè)生精小管橫斷面，以凋亡細(xì)胞數(shù)占每個(gè)生精小管生精細(xì)胞總數(shù)的比例，取其平均值計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)組間均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(t檢驗(yàn))，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩側(cè)睪丸大體改變及重量變化

術(shù)后第7天，除假手術(shù)組外，其余各組大鼠右側(cè)睪丸正常，左側(cè)睪丸體積明顯縮小(圖1)，重量均輕于右側(cè)睪丸，但原花青素組左側(cè)睪丸較其右側(cè)睪丸縮小的程度明顯輕于生理鹽水組，其重量明顯大于生理鹽水組左側(cè)睪丸重量，各組大鼠兩側(cè)睪丸重量變化見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠雙側(cè)睪丸重量變化(mean±SD)

2.2 各組大鼠左側(cè)睪丸的組織學(xué)變化

如圖2所示，假手術(shù)組睪丸生精上皮(圖2 A)中生精細(xì)胞排列有序，生精小管內(nèi)可見(jiàn)到各級(jí)生精細(xì)胞，形態(tài)正常；生理鹽水組均可見(jiàn)到生精小管內(nèi)生精細(xì)胞排列紊亂，生精細(xì)胞與精子的數(shù)量減少，可見(jiàn)較多凋亡小體以及多核巨細(xì)胞(圖2 B)，原花青素組睪丸生精上皮(圖2 C,D,E)較生理鹽水組厚，可見(jiàn)到少量多核巨細(xì)胞，且隨著劑量的升高多核巨細(xì)胞數(shù)量減少。間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變。

2.3 TUNEL法對(duì)生精細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

各組睪丸內(nèi)均可見(jiàn)到胞核為黑褐色的凋亡的生精細(xì)胞，包括初級(jí)精母細(xì)胞，精原細(xì)胞和精子細(xì)胞均可發(fā)生凋亡，假手術(shù)組睪丸(圖3 A)可見(jiàn)散在的少量凋亡細(xì)胞，生理鹽水組睪丸生精小管 (圖3 B)內(nèi)出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，管壁變薄，生精細(xì)胞數(shù)量明顯減少，原花青素組生精小管(圖3 C,D,E)較生理鹽水組出現(xiàn)相對(duì)較少的凋亡細(xì)胞，且隨著原花青素劑量的升高凋亡細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少。各組生精細(xì)胞凋亡指數(shù)見(jiàn)表2。

表2 左側(cè)睪丸生精細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的變化

3 討論

隱睪是常見(jiàn)的男性先天性泌尿生殖系畸形之一，即睪丸未能按正常發(fā)育過(guò)程通過(guò)腹股溝管沿著腹膜鞘突下降至陰囊底部,而停留在下降途中任何部位。在足月男性新生兒中的發(fā)病率為4%～5%,早產(chǎn)兒為9%～30%[4]。目前隱睪癥的藥物治療主要是激素，而本實(shí)驗(yàn)研究的原花青素通過(guò)抗氧化作用保護(hù)隱睪可以為隱睪的藥物治療提供更多的選擇。40多年來(lái)人們對(duì)從眾多不同植物中提取出的原花青素進(jìn)行了大量研究,原花青素得到了最為深入和廣泛的關(guān)注。但是國(guó)內(nèi)對(duì)葡萄籽提取物原花青素在隱睪中抗生精細(xì)胞凋亡的研究還較少。

原花青素是一種良好的氧游離基清除劑和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制劑，并以高效、低毒、高生物利用度而著稱，其主要作用有：①有效地清除超氧陰離子自由基和羥基自由基等，也可中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。②參與磷脂、花生四烯酸的新陳代謝和蛋白質(zhì)磷酸化，保護(hù)脂質(zhì)不發(fā)生過(guò)氧化損傷等[5]。

睪丸生精細(xì)胞凋亡是生精過(guò)程中產(chǎn)生的一種生理現(xiàn)象，而隱睪可使睪丸正常的生精過(guò)程發(fā)生紊亂并可導(dǎo)致生育能力低下。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隱睪術(shù)后大鼠手術(shù)側(cè)睪丸均發(fā)生萎縮，體積、重量均小于對(duì)側(cè)睪丸，組織學(xué)隱睪生精細(xì)胞和精子數(shù)量大大減少，有較多特征性的凋亡多核巨細(xì)胞。這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功制作了隱睪模型。

本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，隱睪所致生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制與活性氧所致的過(guò)氧化有關(guān)[6]，且通過(guò)使用活性氧抑制劑能夠顯著減輕隱睪生精細(xì)胞凋亡的程度。本實(shí)驗(yàn)中研究所用的原花青素是一種良好的抗氧化劑，使用了原花青素的SD大鼠組兩側(cè)睪丸體積、重量變化較生理鹽水組小，且組織學(xué)觀察和TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果都顯示隱睪術(shù)后給予原花青素能使隱睪中生精細(xì)胞的凋亡減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原花青素能顯著抑制隱睪生精細(xì)胞的凋亡，因此我們推測(cè)，原花青素能夠抑制隱睪生精細(xì)胞凋亡是因?yàn)槠淠芤种齐[睪中過(guò)多的活性氧的產(chǎn)生，本研究為臨床治療某些特發(fā)性男性不育癥藥物的開(kāi)發(fā)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也對(duì)隱睪下降術(shù)后改善生精功能的藥物干預(yù)提供了新思路。

[1]豐田娟,徐貴發(fā).葡萄籽提取物抗氧化功能的實(shí)驗(yàn)研究[J].食品與藥品,2007,9(1):17-18.

[2]石金鳳,賴瓊,謝遠(yuǎn)杰.SB203580對(duì)大鼠隱睪生精細(xì)胞凋亡的影響[J].解剖學(xué)雜志,2007,30(2):157-159.

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[4]豐田娟,徐貴發(fā).葡萄籽提取物對(duì)人體抗氧化能力的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,45(10):985-987.

[6]李美香,賀麗萍,謝遠(yuǎn)杰,等.硝普納和L-硝基-精氨酸甲酯對(duì)大鼠生精功能的影響[J].中華男科學(xué),2003,10(5):327-329.

[7]謝遠(yuǎn)杰,李美香,賴瓊,等.N2硝基2L2精氨酸甲酯對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性隱睪生精細(xì)胞凋亡及Bax表達(dá)的影響[J].解剖學(xué)報(bào),2006,37(6):710-712.